196846. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a humán gamma-interferon biológiailag aktív származékainak és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előllítására
1 2 ciókba is beépíthetjük, és így expressziónál fúziós proteineket állítunk elő. Több ilyen jellegű eljárás ismert. Ezek közül példaként megemlítjük az 1930 és 12 494 számú európai szabadalmi iratokat, amelyekben olyan fúziós proteineket írnak le, amelyek ß-galaktozidáz egységet tartalmaznak. Ily módon oldhatatlan fúziós proteineket állíthatunk elő, amelyek az egyéb proteinektől könnyen elválaszthatók és tisztíthatok. Ezeket a fúziós proteineket célszerűen az előzőekben leírt proteolízishez alkalmazhatjuk. A következő példák talmányunk magyarázatára szolgálnak. A példák százalékos adatai — amennyiben egyéb megjelölés nincs — tömeg%-ra vonatkoznak. 1. példa Közvetlen expresszió Az I. ábra szerinti plazmidból (amely az IFN-7- -gént tartalmazza) 10 pg-ot felhasítunk Bam Hl és Sal I restrikciós endonukleázokkal. Ezt követően a maradék plazmidtól körülbelül 340 bp tatalom gén-fragmenst elválasztunk 2%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen és (agaróz előállítására szolgáló utasítása szerint) izoláljuk. Az izolált génfragmens megfelel a (II) DNS-szekvenciából (35-146 amínosav)előállított IFN-I és IFN-II DNS-szekvenciáinak. Erre a fragmensre egy új kombinált génfragmenst kötünk, amely a DNS-szekvencia. MET Pro Tyr Val Lys Glu Alá 5’ AA TTC ATG CCG TAC GTTAAAGAAGCT 3’ (Eco RI) G TAC GGC ATG CAA TTT OTT CGA Glu Asn (leu) (Lys) 5’ GAA AAC . 3’ 3’ CTT TTG GAC TTT 5’ és a II-DNS-szekvencia (IFN-I) lg — Ij oligonukleotidjainak ligálása után keletkezik. Ezután az így előállított és 5 aminosavval megrövidített IFN-y-gént az Eco Rí és Sal I restrikciós enzimekkel felhasítjuk és a 414 bp-t tartalmazó gént 2%-os agarózgélből gén-elektroforézissel elválasztjuk. Az l. ábra szerinti expressziós plazmidot felnyitjuk az Eco Rí és Sal I restrikciós enzimekkel, és 0,7%os agaróz gélen elválasztjuk a benne levő IFN-y-gént, és a maradék plazmidot az újonnan létrehozott megrövidített IFN-y-génnel kötjük, amelyhez segítségül a T4-DNS-ligáz enzimet alkalmazzuk. A ligálást TRISZ-HCl-pufferban, magnézium-kloridban és DTT- val, T4-DNS-ligázzaI végezzük. A megrövidített lFN-y-gént tartalmazó hidridplazmidot E. coli sejtekbe transzformáljuk. Ehhez az E. coli K 12 törzset CaCl2-oldattal 'végzett: kezeléssel kompetenssé tesszük, és a hibridplazmidok CaClj-t tartalmazó, 7,5 pH-jú Trisz-HCI-pufferral készített oldatával kezeljük. A transzformált törzseket ampicillint tartalmazó agarlemezeken szélesztjük. Ezután a megfelelő plazmidokban a megfelelőképpen integrált 7-intcrferon gén-szekvenicát tartalmazó kiónokat DNS-gyorsfeldolgozással (Maniatis) azonosítjuk. Transzformálás után az E. coliba egy 7-interferon-aminosavszekvenciájú és az amino-terminálisan még egy mationilcsoportot tartalmazó polipeptidet exprlmálunk. A kívánt optikai sűrűségre tenyésztett baktériumtörzseket egy alkalmas induktorral, például lPTG-vel, viszonylag hosszú ideig, két óráig inkubáljuk. A sejteket krezol oldattal és benzil-szulfonil-kloriddal elöljiik.Centrifugálásés szűrés után a sejttömeget pufferoldatban szuszpendáljuk (Trisz, EDTA, pH = 7,5) és mechanikusan feltárjuk, például French-prés, illetve DYNO-daráló (gyártó cég: Willy Bachofer, Basel) segítségével, majd az oldhatatlan alkotókat centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszóban lévő ^-interferon aktivitású proteint szokásos eljárással tisztítjuk. A tisztítás történhet ioncserés-, adszorpciós-, gélszűrő oszlopokon vagy affinkromatográfiával. A termék dúsulását és tisztaságát nátrium-dodecil-szulfát-akril-amid gélen és HPLC analitikával ellenőrizzük. Ily módon az IFN-7 6-146 amínosav szekvenciájú polipeptidjét állítjuk elő, amelynek N-terminálja Mettel hosszabb. 2. Példa a) Fúziós protein előállítása Az 1 DNS-szekvenciájú szintetikus génből indulunk ki, és ezt a következő módon a (3-galaktozidáz-génhez kapcsoljuk: Az 1. ábra szerinti plazmidot (vagy az 1. példa szerint előállított rövidített IFNy-szekvenciájú analóg plazmidot) felhasítjuk Sál 1-gyel, és a következő Sal I - Eco Rl-adaptorral kötjük: 5’ TCG ACC CGG GCT G 3’ 3’ GG GCC CGA CTT A A 5’ (Sal I) (Eco Rí) A ligáit termékből elválasztjuk az Eco Rl-vel meghosszabbított gént, amelyet most már mind a két végén Eco Rí jelzőszekvencia szegélyez. Ezután 2%-os alacsony olvadáspontú agarózgéllel tisztítjuk és izoláljuk. A pBH 20 plazmidot (2. ábra) (E. L. Winnacker, Gene und Klone, eine Einführung in die Gentechnologie, VCH kiadó, Weinheim (1984), 233-234. oldal, 12 494 számú európai szabadalmi bejelentés, 1. ábra) ismert módon felnyitjuk az Eco Rí restrikciós enzimmel, és az IFN-y-szekvenciájú gént a linearízált plazmidba helyezzük. Az 1. példa szerint végzett transzformáció és indukció után előállítjuk a fúziós proteint. A fúziós protein a 7-galaktozidáz első, körülbelül 1000 aminosavjához van csatlakoztatva, és az 1FN-7 amínosav szekvenciát (komplett illetve rövidített) tartalmazza. b) Fúziós protein proteolízise A dúsított fúziós proteinből 1 g-ot feloldunk 100 ml 70%-os hangyasavban, és 6 órán keresztül 60 °C hőmérsékleten keverjük. A reakcióidő elteltével az oldatot hűtés közben 4 n nátronlúggal semlegesítjük, és vízzel ötszörös - tízszeres térfogatra hígítjuk. Azért, hogy a kívánt hasítási terméket abszorbeáljuk hozzákeverünk 100 g kovasavat. Az abszorpciót 3 óra alatt 8 °C hőmérsékleten végzett keverés közben folytatjuk le. Ezután a terhelt kovasavat kromatográfiás oszlop ba töltjük, és állandó extinkció. érték eléréséig (278 nm) 50 mmól foszfát-pufferrel, 125 mmól nátrium-kloriddal (pH 7,4) mossuk. Az IFN-7 6-146 amínosav szekvenciájú interferonjának elúcióját 7 mól guanidin-96.846 5 Í0 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
