196846. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a humán gamma-interferon biológiailag aktív származékainak és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előllítására
1 2 196.846 nel, 0,1 tenziddel (poli-oxi-etilén)-szorbitán-mono-iaurát), 0,1 mól trisz-sósavval (pH = 7,4) végezzük. Az eluátumot 0,1 mól trisz-sósavval (pH = 7,4) tízsze- 5 rés térfogatra hígítjuk, és 3-4 órán keresztül 20 °C hőmérsékleten keverjük, miközben renaturáljuk. A dialízist 1000-12000 dalton-os membránnal végezzük, és a dialízist 2 x 10—10 liter 0,6 mól ammónium-hidrogén-karbonáttal szemben, 10 mmól magnézium-szulfáttal szemben (pH = 8) és 1 x 10 liter f0,6 mól) ammónium-hidrogén-karbonáttal szemben (pH = 8) végezzük, majd az IFN-7 oldatot összekeverjük 1,5 g szérum albuminnal és fagyasztva szárítjuk. Ily módon 2,1 g liofilizátumot állítunk elő. A liofilizátumban radio-immuno-assay-val 205 x 107 IFN-y egységet ha- -jg tároztuk meg (kb 40 mg). 3. példa ■y-Interferon savas hasítása 10 mg (géntechnológiailag előállított) 7-interferont 3 ml 70%-os hangyasav oldatban feloldjuk és 16 órán 20 keresztül szobahőmérsékleten keverjük. Ezután az ol datot jeges fürdőben, hűtés közben ammóniás vízzé semlegesítjük és vízzel öt-tízszeres térfogatra hígítjuk. Az így kapott reakcióelegyet 64 mm x 10 mm kromatográfiás kolonnára visszük. A kolonna töltete S-SEPH AROSE (Fast Glow, Pharmica termék). A kolonnát előzőleg 50 mM HEPES-pufferral (pH = 8) egyensúlyba hozzák. Feltöltés után a kromatográfiás oszlopot állandó alapvonal jelig (280 nm) 50 nm HEPES- 0,3 M NaCl (pH = 8) oldattal mossuk. Ezután a találmány szerint előállított 7-interferont 5 M guanidinnel, 50 mM HEPES (pH = 8) pufferral eluáljuk. Renaturáláshoz az eluátumot 50 mM HEPES-pufferral (pH = 8) tízszeres térfogatra hígítjuk és 3-4 órán keresztül 20 °C hőmérsékleten keverjük. 50 mM HEPES-pufferral szemben, 4 °C hőmérsékleten és pH = 7,5-n végzett 16 órán dialízis után a protein oldatot tisztára szűrjük, és egy dializáló csőben (ultra dializáló cső OH 100/10, Schleicher ^Schuell termék, elválasztási határ 10000 D) betöményítjük. Az így kapott protein CPE elektroforézissel WISH-sejtekkel Vesicular Somatitis vírus (USV)-ra specifikus antivirális hatást mutat (2 x 107 egység/mg) és ugyanolyan aktivitású, mint a kiindulási anyag. (I) DNS-szekvencia Triplett sZ. 0 1 2 3 4 5 Aminosavak Met Cys Tyr Cys Gin Asp Nukleotid sz. 1 10 20 Kódoló ág. 5’ AA TTC ATGTGC TAC TGC CAG GAC Nem kódoló ág, 3-G TAC ACG ATG ACG GTC CTG 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Pro Tyr Val Lys Gíu Alá Glu Asn Leu Lys 30 40 50 CCG TAC GTT AAA GAA GCT GAA AAC CTG AAA GGC ATG CAA TTT CTT CGA CTT TTG GAC TTT 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Lys Tyr Phe Asn Alá Gly His Ser Asp Val 60 70 80 AAA TAC TTC AAC GCT GGT CAT TCT GAC GTT TTT ATG AAG TTG CGA CCA GTA AGA CTG CAA 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Alá Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile 90 100 110 GCT GAC AAT GGT ACT CTG TTC CTG GGG ATC CGA CTG TTA CCA TGA GAC AAG GAC CCC TAG 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg 120 130 140 CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAA TCT GAC CGT GAC TTT TTG ACC TTT CTT CTT AGA CTG GCA 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 Lys Ile Met Gin Ser Gin He Val Ser Phe 150 160 170 AAA ATC ATG CAA TCT CAG ATC GTT TCT TTC TTT TAG TAC GTT AGA GTC TAG CAA AGA AAG 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp 4
