196845. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-21978C-származékok előállítására
1 2 Bizonyos A21978.6 törzs jellemzők eltérnek a S. roseosporus törzsre közölt jellemzőktől. Az A21978.6 törzs eltérő a szakirodalomban közölt adatoktól a sárgarépa- és burgonya szeleten való növekedésben, a spóraméretben, a nátrium-kloridtoleranciában és a nitrát redukcióban. A találmány szerinti eljáráshoz kifejlesztett és alkalmazott A21978.65 törzs tulajdonságai megegyeznek az A21978.6 törzsével. Ettől csak a termelt A21978C antibiotikumok mennyiségében tér el. A korábbi törzs legjobb esetben 100 meg A21978 antibiotikumot termelt fermentlé milliliterenként, míg a javított A21978.65 törzs legalább 2,5-ször nagyobb mennyiségű antibiotikumot termel, és rázott fermentációs edényben még 18-szoros mennyiség termelése is elérhető. A nagyban megnövelt A21978C termeléssel az új törzs nagyban javított módszert eredményez ezeknek az antibiotikumoknak az előállítására. Mint más mikroorganizmusok esetében is, a találmány szerinti eljárásban alkalmazott új A21978C termelő Streptomyces roseosporus NRRL 15998 kultúra változatai is létezhetnek. Változatai és mutánsai kaphatók különböző szakirodalomban ismert technikák, mint ultraibolya besugárzás, röntgen besugárzás, nagyfrekvenciás hullámokkal való kezelés, radioaktív besugárzás és vegyszeres kezelés segítségével. A Streptomyces roseospurus NRRL 15998 neutrális és indukált variánsai és mutánsai, amelyek megtartják azt a jellemzőt, hogy nagy menynyiségben termelnek A-21978C antibiotikumokat, ugyancsak alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásban. Á Streptomyces roseosporus NRRL 15998 tenyésztésére igen sokféle táptalajt alkalmazhatunk. Gazdaságossági okokból, hogy optimális termelést érjünk el, hogy a termék izolálása könnyű legy§n, bizonyos táptalajok előnyösen alkalmazhatók. így például nagy méretekben történő termelés esetébén az előnyös szénforrás tapióka dextrin, de glükóz, fruktóz, galaktóz, maltóz, mannóz, gyapotmag olaj és hasonlók szénforrások ugyancsak alkalmazhatók. Előnyösen alkalmazható nitrogénforrás az enzim hidrolizált kazein, de' oldható hús pepton, szójaliszt, szója hidrolizátum, szójamag por, élesztő, aminosavak, mint például L-aszparagin és DL-leucin valamint hasonló nitrogénforrások is alkalmazhatók. A táptalajba keverhető szervetlen tápsók olyan oldható sók, amelyek kálium, klorid, ammonium, szulfát, nitrát és hasonló ionokat képesek szolgáltatni. Ezek között különösen előnyösen alkalmazható antibiotikum termelésben a káliumszulfát. Melasz hamu, hamu dializátum és szintetikus ásványi só keverék ugyancsak alkalmazható. Az A-21978C antibiotikumok termeléséhez előnyösen a fermentáció során desztillált vagy ionmentes vizet alkalmazunk. Bizonyos ásványi anyagok, amelyek a csapvízben találhatók, mint például a kalcium és a karbonát ionok, előnytelenül befolyásolják az antibiotikum termelést. A mikroorganizmus növekedéséhez és fejlődéséhez bizonyos nyomelemek jelenléte is szükséges a táptalajban. Ezek a nyomelemek általában mint szennyezések előfordulnak az egyéb összetevő anyagokban, cs mennyiségük elegendő a mikroorganizmus számára. 8 Kis mennyiségű (például 0,2 ml/1) habzásgátó anyag, mint például polipropilén-glikol adagolása szükséges lehet nagy méretekben végzett fermentáció során a habzás megakadályozására. A jelentős mennyiségű A-21978C antibiotikumok termeléshez előnyösen szubmerz, aerob fermentációs technikát alkalmazunk. Azonban kis mennyiségű A-21978C.antibiotikumok rázott edényben tenyésztett kultúrákból is előállíthatok. Mivel az antibiotikum termelésben nagy késést, időigényt okozhat a mikroorganizmus spóra formájú alakjával való nagy fermentációs tartály inokulálás, erre a célra általában előnyösen vegetatív inokulumot alkalmazunk. A vegetativ inokulumot úgy állítjuk elő, hogy kis mennyiségű táptalajt a mikroorganizmus spóra, vagy micélium formájával inokulálunk és így friss, aktívan növekedő tenyészetet kapunk. Ezután a vegetatív inokulumot a nagyobb tartályba inokuláljuk. Az új A-21978C termelő mikroorganizmus körülbelül 20°C és körülbelül 40°C közötti hőmérsékleten képes növekedésre. Optimális A-21978C termelés körülbelül 30-32°C közötti hőmérsékleten történik. Mint a szubmerz aerob tenyészetek esetében ez szokásos, a táptalajba steril levegőt vezetünk. A hatásos A-21978C termeléshez a tartály levegő telítettsége körülbelül 20% előnyösen 30% (30°C-on, atmoszférikus nyomáson) legyen. A tartályban történő fermentáció során a fermentációs közeg pH értékét előnyösen körülbelül 6,5- 7,0 érték körül tartjuk. Ezt megfelelő mennyiségű nátriumhidroxid (a kezdeti fermentációs szakaszban) és sósav (a későbbi fermentációs szakaszban) hozzáadásával érhetjük el. A fermentáció során az A-21978C antibiotikum termelést a táptalaj vagy micélium extraktumok antibiotikus hatás vizsgálatával követhetjük, amelyet az antibiotikumokra érzékeny mikroorganizmusok alkalmazásával végzünk. Például ilyen vizsgálati mikroorganizmus, amely az antibiotikumok termelésének követésére alkalmas, a Micrococcus luteus, A biotesztet előnyösen papír-korong agar lemezeken való vizsgálattal végezzük. A táptalaj szilárd részét, amely a micéliumot és a táptalaj szilárd alkotórészeit tartalmazza extrakció vagy elválasztás nélkül közvetlenül is felhasználhatjuk, de előnyösen a víz eltávolítása után alkalmazzuk A-21978C antibiotikum forrásként. Például megfelelő A-21978C antibiotikum aktivitás elérése után a táptalajt liofilizálással száríthatjuk, és közvetlenül a tápanyagként alkalmazott premix-be keverhetjük. Az (I) általános képletű vegyületek kiváló antibiotikus hatású anyagok. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon részletesen bemutatjuk. 1. példa A-21978C komplex előállítása Tárolt kultúra formát készítünk, amit folyékony nitrogén gőzterében tárolunk. A folyékony nitrogén gőzterében tárolt Streptomyces roseosporus, NRRL 15998 törzset alkalmazzuk 50 ml alábbi összetételű vegetatív táptalaj inokulálására. 196 845 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 56 60
