196843. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-lizin előállítására
1 2 bacterium glutamicumnak a THPS szintézisében érintett (a továbbiakban THPS génnek vagy dapC-nek nevezett) génjére vonatkozólag. A Corynebacterium glutamicum dapA és dapC génjét tartalmazó DNS-fragmenst először az Escherichia coli gazda-vektor rendszerrel klónozzuk. Gén Eschríchia elöli gazdaszervezettel való klónozására szolgáló eljárást például a Methods in Enzymologyban (Vol.68., edited by Ray Wu and published by Academic Press, New York /1979/) írnak le. Az eljárás részleteiben a következő: Croynebacterium glutamicum ATCC 13032-ből kromoszóma DNS-t extrahálnak, és Escherichia coli pBR322 vektor plazmidot (amely ampicillinre és tetraciklinre rezisztenciával rendelkezik) hasítanak Sal I restrikciós enzimmel, és utána T4 fág DNS-ligázával rekombinálják. Escherichia coli K 12 (hsdR' /host-specific restriction defective, azaz gazdaszervezet-spéci fik us restrikció defektiv/ és dapA' /DDPS-defektív: diamino-pimeünsav igényes/) TM103 altörzset transzformáinak a rekombinált termékkel, és az ampicillint tartalmazó minimáltáptalajon szaporodni képes transzformált mutánsokat szelektálják. A diamino-pimetinsavat nem igénylő és ampicillinre rezisztens transzformált mutánsok tenyésztetett sejtjeiből a plazmid szokásos módszerrel elkülöníthető. Után a plazmid DNS-t restrikciós enzimekkel hasítják, és az így keletkező DNS-fragmenseket agarózgél-elektroforézissel analizálják, miáltal szerkezetük meghatározható. Az így kapott plazmidok egyike pCDl. A pCD 1-nak olyan szerkezete van, hogy egy 4,2 kilobázis (Kb) hosszú Sal I DNS-fragmens betoldás van a pBR322 egyedüli Sal I hasítási helyén (lásd 1. ábra). A DDPS-dei'ektív mutáns AT998 törzs (Hfr dapAló) és a THPS-defektív mutáns AT997 törzs (Hfr dapC15), amelyek Escherichia coli altörzsek (J. Bacteriol. 105, 844 /1971/), illetve pCDl DNS transzformálásával kapott ampicillin-rezisztens transzformáit mutánsok egyike sem igényel diamino-pimelinsavat, és ebből a tényből, nyilvánvaló, hogy a 4,2 Kb-os pCDl Sal I DNS-fragmensén vannak a Corynebacterium glutamicum dapA és dapC génjei, amelyek az Escherichia coli DDPS és THPS génhiányait helyesbitó funkciót kódolják. Úgynevezett ingázó típusú (shuttle-type) rekombináns pAC2 plazmid - amely replikálódára képes a Corynebacterium, Brevibacterium és Escherichia nemzetségekhez tartozó mikoorganizmusokban — keletkezik a pCDl-en klónozott dapA-t és dapC-t tartalmazó 4,2 Kb-os Sal I DNS-fragmensnek a pFCl8 plazmid (amely tetraciklin- és spektrinomicin-rezisztenciával rendelkezik) egyedüli Sal I hasítási helyére való betoldásával. A pDC18 plazmid egy ingázó típusú (shuttle-type) vektor plazmid, amelyet a Corynebacterium és Brevibacterium nemzetségek pCGll vektor plazmidjának Escherichia coli pBR322 vektor plazmidjának a Pst 1 hasítási helyére való betoldásával állítottak elő korábban a feltalálók lásd a 134500/82 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentést. Az említett plazmid előállítására szolgáló eljárást és a plazmid szerkezetét az 1. ábrán mutatjuk be. ’ A pAC2 plazmidot a következő műveletekkel állítjuk elő: pFC18 és pCDl plazmid DNS-eket hasítunk Sál I restrikciós enzimmel, majd összekeverjük egymással. és T4 ligáz hatásának vetjük alá. Utána DDPS-génhiányos Escherichia coli K 12 T103 altörzset transzformálunk a ligációs eleggyel, és a spektinomicint tartalmazó minimáltáptalajon szaporodó transzformált mutánsokat szelektáljuk. Az így kapott spektrinomicinre rezisztens és dianino-pimelinsavat nem igénylő transzformáit mutánsok egyikének elszaporított sejtjeiből plazmid DNS-t extrahálunk. A plazmid DNS elkülönített Sal I hasítási termékét agarózgél-elektroforézisnek vetjük alá a plazmid szerkezetének vizsgálata céljából. Megállapíthatjuk, hogy a plazmid szerkezete olyan, hogy a pCDI-ből származó 4,2 Kb-os Sal I DNS-fragmens a pDC18 vektor plazmid Sal I hasítási helyére illeszkedik be. Ezután DDPS-génhiányos AT998 mutáns törzset és THPS-génhiányos AT997 mutáns törzset — amelyek az Escherichia coli K 1 2 törzs altörzsei - transzformálunk az említett plazmiddal, és — mivel a génhiány a mutánsok mindegyikében helyesbítődik — megerősíthetjük, hogy az egyszer pCDl-en klónozott Corynebacterium glutamicum dapA és dapC beépült az említett plazmidba. Az említett plazmidot nevezzük pAC2-nek (lásd 1. ábra). Corynebacterium glutamicum RH 6 törzset, egy mutációval kiváltott homoszerin-igényes lizintermelő törzset (a törzs FERM-BP 704 néven van letétbe helyezve a Fermentation Research Institute-ben, az Agency of Industrial Science and Technology-nál) transzformálunk pAC2 plazmiddal. A transzformáció a Corynebateriuin vagy Brevibacterium nemzetséghez tartozó valamelyik törzs protoplasztját használó transzformációs módszerrel történhet, amelyet a feltalálók fedeztek fel, és amelyre szabadalmi bejelentéseket tettek. (Lásd a 186492/82 és 186489/82 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentéseket.) A Corynebacterium glutamicum RH 6 törzs protoplasztját az említett módszer szerint transzformáljuk, és utána a transzformált mutánsokat spektinimicint tartalmazó regenerációs táptalajon szelektáljuk. Az így kapott spektrinomicin-rezisztens transzformált mutánsok egyikének szaporított sejtjeiből elkülönített plazmidot az előző bekezdésben leírtak szerint a hasonló restrikciós enzimmel végzett hasítás-sál és agarózgél-elektroforézissel szerkezet vizsgálat- JgU nak vetjük alá, és megerősítjük a dapA és dapC jelen- ' * létét az Escherichia coli K 12 törzs AT998 és AT997 altörzseinek transzformációs vizsgálatához hasonlóan. Az L-lizinek a pAC2 transzformált mutáns segítségével való előállítása az L-lizin fermentációval történő előállítására szolgáló szokásos eljárásokban alkalmazott tenyésztési módszerek szerint végezhető. Tehát, ha a transzformált mutánst valamilyen szénforrást, nitrogénforrást, szervetlen anyagokat, aminosavakat, vitaminokat stb. tartalmazó szokásos táptalajon aerob körülmények között szabályozott hőmérsékleten, pH- nál stb. tenyésztjük, akkor lizin keletkezik, és felhalmozódik a táptalajban. Az L-lizin a táptalajból szokásos módszerekkel, például aktívszenes kezeléssel, ioncserélő gyantás kezeléssel tb. nyerhető ki. Ilymódon L-lizin a Corynebacterium vagy Brevibacterium nemzetségekhez tartozó pAC2-t tartalmazó valamelyik törzs alkalmazásával magasabb kitermeléssel állítható elő, mint olyan törzs alkalmazásával, amely nem tartalmaz pAC2-t. A jelen találmány hasznossága abban van, hogy megalapozzuk vagy fokozzuk az L-lizin-termelőképességet egy olyan rekombi-196.843 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
