196843. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-lizin előállítására
1 2 náns DNS-nek a Corynebacterium vagy Brevibacteriuin nemzetségbe tartozó törzsbe való bevitelével, amely DNS-hen a DDPS és/vagy THPS gének a Corynebaeteritim vagy Brevibacterium nemzetség valamelyik törzséből származó vektor a jellegzetesség kifejezésére képes formában'van rekombinálva. A jelen ta-. lálmánvi leírásban Corynebacterium glutamicumból származó DDPS vagy THPS szintézisében érintett gének alkalmazásával egy példáját mutatjuk be. Lizintermelő mikroorganizmusok lizin-termelőképessége Úgy is fokozható, ha más szervezetek megfelelő génjeit használjuk az említett gének helyett. A vektor plazmid csak autonóm replikálhatóságot biztosít a rekombinált DDPS vagy THPS szintézisében érintett gének stahil öröklése esetén. Úgy nem csak a jelen találmányi leírásban példaként felhozott pFClS, hanem a Corynebacterium vagy Brevibacterium nemzetség valamelyik mikroorganizmusában lévő autonóm replikálható plazmidok és a gadaszervezet egy kromoszómájába való beépülés révén stabil öröklődésre képes fág vektorok is használhatók. Számos közös mikrobiológiai tulajdonságuk ellenére nagy glutaminsav termelőképességgel rendelkező mikroorganizmusokat (úgynevezett glutaminsavtermelő mikroorganizmusok) kutatók különböző fajokba sorolnak be, cs még olyan nemzetségekbe, mint a Corynebacterium és Brevibacterium valószínűleg ipari jelentőségük miatt. Kimutatták azonban, hogy ezeket a mikroorganizmusokat egy fajként kell osztályozni, mivel a sejtfalakban lévő aminosavakban és a DNS GC-'artalmában megegyeznek. Leírták, ezekben a mikroorganizmusokban több. mint 70-80% egyezés van DNS-DNS hibridizációban, ami a mikroorganizmusok nagyon közeli rokonságát jelzi (lásd erre vonatkozólag Komatsu Y.: Report of the Fermentative Research Institute, No. 55, 1 /1980/ és Szuzuki K., Kaneko T. and Komagata K.: Int.J.Syst. Bacteriol, 31, 131 /198)/). A jelen szabadalmi leírásban egy olyan esetet adunk meg. ahol egy rekombináns DNS-t viszünk be Corynebacterium glutamicum RH 6-ba, és a gén kifejezésétől függ az L-lizin termelés javulása. Tekintve a gluiaminsavtcrmelő mikroorganizmusok előbb említett közeli rokonságát, teljesen elfogadható, hogy a jelen találmány az összes glutaminsavtermelő mikroorganizmusra alkalmazható. A jelen találmány eredménye attól függ, vajon a rekombináns DNS autonóman rcplikálódik-e a glutaminsavtermelő mikroorganizmusban. és vajon kifejeződik-2 a gén, és a glutaminsavtermelö mikroorganizmusok közötti ilyen DNS-egyezés ennyire kis különbsége elhanyagolható-e. Az, hogy a glutaminsavtermelő mikroorganizmusok rendelkeznek azzal a közös tulajdonsággal, hogy lehetővé tegyék plazmidok replikációját és gének kifejezését, nyilvánvaló abból tényből, hogy a pCG4 pla/mid. amelyet Corynebacterium glutamicum 225 250-ből izoláltak (lásd a 183799/82 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentést), és amelynek spektinomicin- és/vagy sztreptomicin-reziszteneia génjeii) van(nak), általánosan replikálható és kifejezhető glutaminsavtermelő mikroorganizmusokban, így például a Corynebacterium és Brevibacterium nemzetségekhez tartó törzsekben (186492/82 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés). A jelen találmány feltalálói további kimutatták azt is, hogy a Brevibacterium nemzetség egyik baktériumának triptofán-bioszintetizáló génje kifejezhető a Corynebacterium nemzetség valamelyik baktériumában, és a Corynebacterium nemzetség egy baktériumának hisztidin-bioszintetizáló génje kifejezhető a Brevibacterium nemzetség valamelyik baktériumában (lásd a 25398/83 és 25397/83 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentéseket). így tehát nyilvánvaló, hogy a gének kölcsönösen kifejezhetők ezen két nemzetség baktériumai között. Ennek megfelelően azok a baktériumok, amelyekre a jelen találmány alkalmazható, nemcsaka Corynebacterium glutamicumot jelentik, 1 ment a Corynebacterium és Brevibacterium nemzet „ghez tartozó összes glutaminsavtermelő mikroorganizmust. A jelen találmány egyik jellemző megvalósítását a következő tipikus példákkal szemléltetjük. 1. példa: (1) Escherichia coli K 12 gazdaszervezet-specifikus restrikció-génhiányos mutációval és DDPS-génhiányos mutációval rendelkező TM103 altörzsek létrehozása A Corybactcrium glutamicum DDPS szintézisében érintett génjének, amely idegen gén, egy Escherichia coli gazdaszervezet-vektor 'rendszerbe való könnyebb klónozhatósága érdekében egy egyidejűleg gazdaszervezet-specifikus restrikció-génhiányos mutációval (hsdR2‘) cs DDPS-génhiányos mutációval dapA 16') rendelkező Escherichia coli törzset hozunk létre gazdaszervezet mikroorganizmusként a következő módon. Escherichia coli K 12 egy restrikció-génhiányos mutációval rendelkező WA802 altörzsből (Escherichia coli K 12 WA802, PERM BP-718) (F' met Bl hsd R2: J. Mol.Biol.16, 1 18 /1966/) származott egy 25 íJtg/ml rifampicinre rczisztens spontán mutáns RF82 törzs. Az RF82 törzset és egy DDPS-génhiányos AT998 mutáns (Hfr dapAI6) törzset (Escherichia coli K 12 AT998, FERM BP-720) 37 °C-on 3 óra hosszat tenyésztünk 50 ng/ml diamino-pimelinsavat tartalmazó L táptalajon (1% baktotripton •/Difco/, 0,5% élesztőkivonat /a Daígo Eiyo Kagaku K.K., Japán gyártmánya/ és 0,5% NaCl, nátrium-hidroxiddal pH 7,0-ra állítva). A sejteket kétszer mossuk fiziológiás sóoldattal, centrifugáljuk, majd utána a mosott sejteket 25 pg/ml ridampicint és 50 Mg/ml diamino-pimelinsavat tartalmazó M9 agaros minimáltáptalaj lemezen (literenként 2 g glükózt, 1 g antmónium-kloridot, 6 g diiiátrium-hidrogén-foszfátot, 3 g kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,1 g magnézium-szulfát-heptahidrátot, 15 mgkalcium-klorid-dihidrátot,4 mg tiamin-hidroklorídot és 15 g agart tartalmazó, és 7,2 pH-ra állított táptalaj) szélesztjük, és a rifampicinre rezisztens és metionint nem igénylő transzkonjugált mutánsokat szelektáljuk. A transzkonjugált mutánsokból szelektáljuk a diamino-pimelinsavat igénylő és restrikció-génhiányos mutáns törzseket, és az egyik ilyen törzset nevezzük TM103-nak. A restrikció-génhiányos mutáció jelenlétét a CóOOr'm" (ATCC 33525 ) törzsön, egy modifikáció-génhiányos Escherichia coli K 12 törszön (M. Meselson: J. Mól. Bioi., 9, 734 /1964/) szaporított X fág lemeztenyésztési eredményességén határozzuk meg. X fágot Escherichia coli K 12 ATCC X lizogén baktériumból preparálunk szokásos módszer szerint. Azaz egy olyan törzset, amely a WA802-ével azonos lemeztenyésztési eredményessé196.843 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
