196842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid DNS és az ezet tartalmazó kötő készítmények előállítására
1 2 ciát hordozó, transzformáló kifejeződő vektorral vagy plazmiddal transzformált gazdasejtet tenyésztjük. Az clábbiakban részletesen ismertetjük az rFv előállítását hibrid DNS technikával. 1. A megfelelő DNS-szekvencia izolálása A DNS előállítására a változó régiót meghatározó génekre van szükségünk. A változó régiók származhatnak az IgA-, IgD-, IgE- vagy az IgM-ből, általában az IgM- és az IgG-ből. Ezt úgy akpjuk, hogy megfelelő gerinces állatot, átalában háziállatot, leggyakrabban egeret immunizálunk. Az immunizálást a szokásos módon, az immunogén egyszeri vagy ismételt injektálásával végezzük, általában emlőssel, és általában két-három héten át. Az utolsó injekciót követő harmadik napon eltávolítjuk a lépet, sejtekre bontjuk és a sejteket hibridoma előállítására fuzionáljuk. Az immunogénként egy adott antigént használunk, vagy ha hapten van jelen, úgy a hapten és az antigén antigenikus komplexét alkalmazzuk. A hibridoma előállítására a iépsejteket fuzionáló szer, például polietilén-glíkol 6000 (PEG6000) jelenlétében több inter- vagy intraspecifikus mieloma sejttel fuzionáljuk, előnyösen egérsejtekkel, például SP-2/0, NS-I stb. sejtekkel, majd HAT szelektív tápoldatban szuszpendáljuk. A túlélő sejteket Mikrotiter csövekben növesztjük és az adott ligandra nézve antitestként viselkedő termék termelését megállapítjuk. Az antitestek meghatározása jól ismert módszerekkel történik, jelzett antigéneket vagy hapténeket használhatunk, a jelzettséget radioizotóppal, fluoreszcenciával, enzimekkel stb. érjük el. Használhatunk más módszereket is, például két antitestet felhasználó szendvics-módszert, ahol az egyik antitestet a hordozóhoz kötjük, és a másikat jelezzük. A Mikrotiter csöveken lévő pozitív sejteket hígítással vagy lágy agáron klónozzuk. Az így kapott sejtvonalakat szaporítjuk, a szaporítás megfelelő tápoldatban történik. A sejteket szükség esetén folyékony nitrogénben fagyasztva tároljuk. Az adott monoklónozott antitestet termelő sejtvonal szelektálása után tenyésztjük a sejteket. A tenyésztést addig folytatjuk, mig 1 liter tenyészetben milliliterenként IxlO6 sejtet kapunk. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük, majd lizáljuk. Az adott DNS-szekvencia izolálására a változó szakaszt kifejező gént vagy a változó szakaszt kifejező mRNS-t keressük. A genomban lévő DNS vizsgálata során szembe kell nézni a nehézségekkel, hogy a változó szakaszt meghatározó szekvenciákat intronok választják szét. Izolálnunk kell a megfelelő exonokat tartalmazó DNS fragmens(eket), ki kell vágnunk az intionokat és ezután össze kell kapcsolnunk az exonokat mégpedig megfelelő sorrendben és orientációban. Általában ezt nehéz kivitelezni, így az mRNS-t felhasználó módszert választjuk. Ha az mRNS-t használjuk, a sejtek lizisét a ribonukleáz enzim gátlása közben végezzük. Az érett mRNS használatakor azonban szembe kell néznünk azzal, hogy nem teljes reverz transzkripció történhet, de ez minimalizálható. Első lépésként izoláljuk az mRNS-t. A poliadenilezett mRNS könnyel leválasztható a töljbi RNS molekulától o!igo-(dT)-cellulóz oszlopont. így olyan mRNS keveréket kapunk, amely mentes más RNS molekulától. Az immunglobulin polipeptid nehéz és könnyű láncát meghatározó szekvenciákat használjuk, ezeket megfelelő forrásokból megkaphatjuk (lásd például Early és Hood, Genetic Engineering, Setlow és Hollanders szerk., 3. kötet, Plenum Publishing Corp., New York, 1981, 157-188. oldal). A hibátlan immunglobulint leíró mRNS meghatározható in vitro transzlációval, nyúl retikulocita sejtmentes kivonatot használva (Pleham és Jackson, Eurp. J. Biochem., 77 247-256, 1976). A kapott transzlációs termék izolálható az adott lánc egy vagy több szakaszára specifikus antitestekkel, például nyúl anti(egér IgC)-vel, ahol a láncok egér immunglobulinból származnak. Az immuncsapadékot poliaktil-amid gélelektroforézissel tovább analizálhatjuk, a komplexek jelenlétét antigén-antitest komplexekre érzékeny radioaktívan jelzett receptorokkal bizonyítjuk, például S. aureus A proteinnel, Rf-faktorral stb. Á hibátlan mRNS jelenlétét bizonyítjuk továbbá RNS hibridizációval (agaróz gélen való szétválasztással, az mRNS nitrocellulóz szűrőre viteléve, 80 °C hőmérsékleten forralva és radioaktív próbával vizsgálva). A kívánt mRNS szekvenciákat tartalmazó nyers mRNS keveréket az alábbiak szerint kezeljük. Okayama és Berg módszerét (Mol.Cell. Bioi., 1982) használva növeljük annak valószínűségét, hogy teljes hosszúságú cDNS-t kapjunk. Eljárhatunk azonban Efstradiadis és Villa-Komaroff módszere (Genetic Engineering Pirciples and Methods, 1, Setlow és Hollaender szerk., New York, Pin um Press, 15-36. oldal, 1979) vagy Steinmezt és munkatársai szerint is (Cell, 24, 125- -134, 1981.) A cDNS első szálát vírus reverz transzkriptázzal állítjuk elő oligo-(dT)-primer jelenlétében. A második szálat ezután reverz transzkriptázzal és a DNS polimeráz I Klenow-fragmensével vagy TH poümerázzal állítjuk elő. Ha szükséges, a kapott kétszálú cDNS-t egyszálú DNS-re specifikus nukleázzal, például SÍ nukleázzal kezeljük a kétszálú cDNS-en lévő egyszálú szakaszok eltávolítására, majd a kapott cDNS-t klónozzuk. 2. Az L-rFv-t és a H-rFv-t meghatározó gének előállítása és kifejeződő vektorba juttatása sokszorosításra Az immunglobulin könnyű és nehéz láncainak előállítására a kétszálú cDNS-t sokszorosítás vagy kifejezés céljából több vektor molekulába beépíthetjük. A megfelelő restrikciós hellyel bíró vektor molekulát megfelelő restrikciós endonukleázzal kezeljük. Az mRNS reverz transzkripciójával kapott cDNS-t linkerek hozzákapcsolásával, terminális transzferázzal kezelve vagy komplementer vagy tompa végek előállításával módosíthatjuk. A vektor molekula a transzformánsok szelektálására egy, kettő vagy több markert tartalmazhat. Előnyös az a vektor, amely több marker közül egyen belül egyetlen restrikciós szakaszt tartalmaz, így a transzformánsok szelektálhatok az egyik marker kifejeződése és a másodikmarker kifejeződésének hiánya alapján. Markerként használhatunk biocid rezisztencia markert, auxotróf komplementációt, virus immunitást vagy hasonlókat. Az mRNS-ből előállított készálú cDNS-sel megfelelő gazdasejtet, általában baktériumot, például E. colit, B. subtilist, S. Cerevisiae-t stb. transzformálunk. A transzformációt ismert módszerekkel végezzük, a transzformánsokat agar lemezekre szélesztjük és a 196.842 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
