196842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid DNS és az ezet tartalmazó kötő készítmények előállítására
1 2 markereknek megfelelően szelektáljuk. A kapott telepeket restrikciós elektroforetikus képük, jelzett pró* bához való hibridizációval vagy más ismert módszerekkel vizsgáljuk (lásd például Hanahan és Meselson, Gene, 10, 63-67, 1980). Az, egyik módszer szerint előállítására szilárd halmazállapotú táptalajon növesztjük. A telepek sejtjeit nitrocellulóz replika szűrőre juttatjuk, majd tovább növesztjük az átvitt sejteket és lizisükct követően szárítjuk és 80 °C hőmérsékleten kezeljük. A replika szűrőt megfelelő radioizotóppal jelzett próbákkal hibridizáljuk. A különböző emlős immunglobulinok állandó szakaszaiban jelen lévő determináns kötőhelyek próbái könnyen hozzáférhetők. A telepeket az adott immunglobulin természete vagy az adott immunglobulinban jelen lévő különböző determináns helyek alapján vizsgáljuk. A próbával hibridizálódó telepeket, azaz azokat, amelyek tartalmazzák a könnyű vagy nehéz láncot meghatározó DNS szakaszt, elkülönítjük és szelekciós körülmények között tenyésztjük. A szelekciós körülmények fenntartása érdekében kívánatos, hogy a használt vektor DNS biocid, előnyösen antibiotikum rezisztenciát határozzon meg. A tenyészetből megfelelő növesztést követően, előnyösen centrifugálással elkülönítjük a sejteket. Ezután ismert módszerekkel (például Gunsalus és munkatársai, J. Bact., 140, 106-1 33, 1979 módszerével) elkülöníthető a hibrid plazmid DNS. Az elkülönített plazmid DNS-t restrikciós endonukleázos analízissel és DNS-szekvenálással analizáljuk. Az analízis adatai bizonyítják, hogy az izolált cDNS kiónok teljes mértékben kódolják a változó szakaszt és kedvező esetben az adott immunglobulin nehéz vagy könnyű láncának vezető szekvenciáját. A változó szakaszok, vezető és semleges szekvenicák restrikciós térképének ismeretében meghatározhatjuk azt a restrikciós helyet, ahonnal egy DNS szakaszt kihasíthatunk és módosíthatjuk abból célból, hogy vektor DNS-be építhessük és kifejezhessük az adott polipeptidet. Abban az esetben, ha a semleges régiók megfelelő pozíciójában nincs egyedülálló restrikciós hely ügy részleges emésztést végzünk és szelektáljuk azo kát a fragmenseket, amelyek tartalmazzák a változó régiót és előnyösen a teljes vezető szekvenciát is. Ha az 5’- és 3’-semleges szakaszoktól hosszúak, Bal 31 részleges emésztéssel rövidíthetjük azokat. A nehéz és könnyű lánc változó szakaszainak C-terminális részén lévő kódoló szál DNS-szekvenciájának ismeretében az alábbi eljárással stop kodon építhető be a C-terminális részbe. Az in vitro mutagene - zist úgy végezzük, hogy a cDNS-t a megfelelő enzimekkel) hasítjuk, amiután a változó szakaszt meghatározó szegmensen kívül 5’-3’-semleges szekvenciákat tartalmazó molekulát kapunk. Ezt a szegmenst például gélelektroforézissel, sűrűségi gradiens centrifugálással stb. tisztítjuk. Izolálást követően szétválasztjuk a szegmens két szálát, ezt forralással végezzük. Az intakt cDNS plazmid klón felesleges szálát hasíthatjuk és emészthetjük. Szintézissel előállítunk egy olyan egyszálú oligonukleotidot (DNS oligomert), amely legalább 12, általában 15 nukleotid bázist, de gyakran 50-nél, általában 30 nukleotidnál kevesebbet tartalmaz, mivel túl hosszú oligomerre nincs szükségünk. Ahol ezt a szintetikus DNS oligomert használjuk a heteroduplex előállítására a nem komplementer nuk leotidokat a hibridizált szállal komplementer legalább három, gyakrabban legalább hat nukleotiddal egészítjük ki A heteroduplex DNS oligomer komplementer a vezető-szekvencia és a változó szakasz, vagy a változó szakasz és az állandó régió közötti szakaszokkal. A DNS oligomer gyakorlatilag komplementer a változó szakaszt kódoló (sense) szekvenciával, de tartalmaz a változó szakasz C-terminális részén egy terminációs kodont. Azaz a DNS oligomer a kódoló szálra komplementer, kivéve «annál az aminosavnál, amely a változó szakasz ésa könnyű és nehéz láncok D-, J- vagy C-régiójának kapcsolódási helyén, különösen pedig a D- vagy J-szakaszon vagy a J-szakaszon belül, vagy a J- és C-szakasz kapcsolódási helyén helyezkedik el. Úgy tervezünk, hogy az előállított polipeptidben bizonyos variáció jön létre a változó szakasz hoszszában vagy olymódon, hogy a változó szakasz C-terminális részén lévő aminosavak közül nem tartalmazza mindegyiket. Megfelelő szoros hibridizációs körülmények között a restrikciós fragmens denaturált száljaihoz fölös mennyiségű DNS oligomert kapcsolunk. Igv a DNS oligomer specifikus heteroduplexet alkota kódoló szál komplementer szakaszával, ugyanakkor egy vagy több stop kodon is létrejön a megfelelő C-terminális aminosav kifejeződésének terminálisa céljából. A megfelelő szoros hibridizációs reakciót megfelelő időn át végezzük, majd megfelelő mennyiségben adagoljuk a négy dezoxi-nuklcotidot a DNS polimeráz I Klcnow-fragmensével együtt. A primer enzimatikus meghosszabbításával szintetizáljuk a változó szakasz kódoló száljára komplementer és bármely 5 -irányban húzódó szekvenciát, amiután olyan szekvenciát kapunk, amely komplementer árra a szálra nézve, amelyhez a DNS-szekvenciát, amely a szintetikus oligonukleotidhoz hibridizált szakaszhoz képest 3 -irányban helyezkedik el, a DNS polimeráz $’-5 -exonukleáz aktivitását felhasználva emésztjük. így olyan kétszálú cDNS-t kapunk, amely specifikusan határozza meg a változó szakaszt és ellenkező irányú a könynyű és nehéz láncok túlnyomó szakaszaihoz képest. A nehéz és könnyű láncok mindegyike olyan kodont tartalmaz, amely a kifejeződést V-, D- vagy J-régiók előre meghatározott kodonja mellett megállítja. Az előállított heteroduplex, tompa végű, kétszálú cDNS fragmenseket ezután felhasználjuk annak az egyébként homoduplex kétszálú cDNS előállítására, amely a megfelelő helyeken stop kodonokat tartalmaz és meghatározza a könnyű és nehéz változó szakaszokat. Előnyösen úgy járunk el, hogy, vagy a fentiek szerint módosítjuk a tompa végű fragmenseket, például a változó szakasz szekvenicájában hiányzó restrikciós helyeket meghatározó linkerekhez kötjük, vagy végénél meghosszabbítjuk, például poliG vagy poliC szekvenciát kapcsolunk hozzá, de felhasználhatjuk beépítésre közvetlenül is. A restrikciós helyet tartalmazó linkerhez kötött fragmens megfelelő komplementer végekkel rendelkező vektor DNS-hez köthető, majd ezután adott esetben a kötőhelyek resktrikciós endonukleázos hasításával onnan visszanyerhető. A linkereket a tompa végű fragmensekhez megfelelő ligázzal, például T4 ligázzal kötjük, a kapott ligáit fragmenst pedig kohézív végű rövidebb fragmens előállítására restrikciós enzimmel kezeljük, a rövid fragmens egy vektor komplementer végeihez köthető. Az előállított vektor DNS alkajmas amplifikálásra 196.847 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
