196842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid DNS és az ezet tartalmazó kötő készítmények előállítására
1 2 az adotl egyszálú cDNS-re komplementer szálat szintetizálunk DNS-polimerázzal, amikor olyan kétszálú eDNS-t kapunk, amelynek kódoló szálja az adott könnyű vagy nehéz láncot határozza meg, és ahol a kódoló szál az adotl immunglobulinra jellemző vezető szekvenciát, változó és konstans szakaszt meghatározó I)NS-szekvenciákat tartalmaz 5 -3 -irányban, a kapott kétszálú eDNS-t klónozzuk, B). az adott könnyű vagy nehéz lánc adott változó szakaszával szomszédos régiókat meghatározó DNS legalább egy részét eltávolítjuk úgy, hogy a klónozott kétszálú cDNS-t kódoló és nem kódoló szálakra választjuk, a nem kódoló szálhoz, olyan oligonukleotid primer! hibridizálunk, amely a változó szakasz kifejeződését lehetővé tevő iniciációs helyet meghatározó inlciációs kodont tartalmaz, az oligonukleotid primer komplementer a vezető szakasz N-terminális végét meghatározó szekvenciával vagy részlegesen komplementer a vezető szakasz és a változó régió találkozási helyét meghatározó DNS-szekvenciával és egy nem komplementer iniciációs kodonna! rendelkezik az ■ adott létrehozott első duplex molekulát enzimatikusan kezeljük a duplex 5 -3 irányban való meghosszabbítására, amikor a nem kódoló egyszálú cDNS-t egészen az első oligonukleotid primcrrel komplementer szekvenciáig, a miután N-terminálisan meghatározott kétszálú cDNS-t kapunk, az N-terminálisan meghatározott kétszálú cDNS-t klónozzuk, a kapott N-tcrminiálisan meghatározott kétszálú cDNS-t kódoló és nem kodoló szálakra választjuk szét, a kódoló szálhoz stop anti-kodont tartalmazó, de egyébként az adott változó szakasz és állandó szakasz határát meghatározó résszel komplementer szekvenciát tartalmazó második oligonukleotid printert hibridizálunk, amikor megkapjuk a második duplex molekulát, ahol a stop anti-kodon a változó szakasz végén helyezkedik el, ezután a kapott duplexet enzimatikusan kezeljük a második oligonukleotid primer S’-3 -irányban való meghosszabbítására a kódoló szálra komplementer módon, majd a második irányban, a második oligonukleotid primerre komplementer szekvenciáig leernésztjük a kódoló egyszálú cDNS-t, amiután olyan N- és C-terminálisan meghatározott kétszálú cDNS-t kapunk, amely egy adott immunglobulin könnyű vagy nehéz, láncában lévő változó régiót határoz meg, az állandó szakasz kódja pedig hiányzik, az N- és C-terminálisan kialakított kétszálú cDNS-t klónozzuk, a/ N- és C-terminálisan meghatározott kétszálú cDNS-t beépítjük egy kifejeződő vektorba vagy plazmidba, a beépítés úgy történik, hogy a kódoló szekvencia megfelelő kapcsolatban legyen a transzkripciós és transzlációs szabályozó jelekkel. Az első oligonukleotid primer homoduplex lehet az említett vezető szekvencia N-terminális nem kódoló szálára nézve, vagy hidridizálva lehet az említett vezető szekvencia és a változó szekvencia találkozási helyére abból a célból, hogy a változó szakaszt meghatározó DNS-szekvencia N-terminális részébe egy iniciációs kodont építsünk be. A cDNS láncra nézve legalább egy oligonukleotid primer csak részlegesen komplementer. A találmány szerinti eljárásba egy további lépést is beiktathatunk a fenti beépítés előtt, nevezetesen az N- és C-terminálisan hasított készálú cDNS-be restrikciós linkereket (felismerőhelyek) építhetünk be, majd a linkereket enzimatikusan hasítva kohézív (ragadós) végeket hozunk létre. Mindegyik hibridizációs lépést követő klónozás után olyan kiónokat szelektálhatunk, amelyek rendelkeznek az említett első vagy második oligunkleotid-szekvenicával, majd izoláljuk a kétszálú cDNS-t tartalmazó DNS-t és újra klónozzuk. A találmány szerinti eljárással olyan kétszálú cDNS-t hordozó transzformáló kifejeződő vektor vagy plazmid állítható elő, amelyben a cDNS-szekvencia egy protein vagy enzim csak egy adott polipeptid láncrészletét határozza meg, és amely DNS-szekvencia az 5 - illetve a 3 -végen iniciációs, illetve terminációs kodonnal rendelkezik. Úgy járunk el, hogy az, adott proteint vagy enzimet meghatározó mRNS-ből cDNS-t állítunk elő, a kétszálú cDNS-ről az adott polipeptid láncon kívül eső nukleotid.szekvenciákat eltávolítjuk és az 5’illetve a 3 -végen iniciációs, illetve terminációs kodont építünk he, amikor olyan meghatározott, kétszálú cDNS-hez jutunk, amely az adott polipeptid lánc egy adott részét határozza meg, majd ezt követően az előállított hasított, kétszálú cDNS-t kifejezésre egy kifejeződő vektorba építjük be A találmány szerinti eljárás és különösen az a-f. pontokban megadottak tetszés szerint adaptálhatók. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint előre meghatározott ligandra specifikus immunoglobulin könnyű vagy nehéz Ián cában található változó szakasz legalább egv részét adó aminosav-szekvenciát tartalmazó kötő polipeptidet állítunk elő, ahol az aminosav-szekvencia az analóg pinc kötőspccifitásával rendelkezik. Úgy járunk ei, hogy az adott láncot meghatározó mRNS-ből előállítunk legalább egy könnyű vagy nehéz láncot mégha tározó cDNS-t, a változó szakaszon kfvíileső nukleotid-szekvenciá kát eltávolítjuk a kétszálú cDNS-ről, majd az 5 • Illetve a 3 -végeken iniciációs, illetve terminációs cDNS-t kapunk, amely az adott változó szakaszt meghatározza, az előállított, hasított, kétszálú cDNS-t kifejezésre egy kifejeződő vektorba építjük és gazdasejtet transzformálunk a meghatározott, kétszálú cDNS-t hordozó kifejeződő vektorral, a transzformált sejtet tenyésztjük, amikor az adott könnyű vegy nehéz lánc kötő polipeptidje kifejeződik, végül izoláljuk az adott kötő polipeptidet. A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös kivitelezési változata szerint előre meghatározott ligandra specifikus immunglobulin könnyű vagy nehéz láncában található változó szakasz legalább egy részét adó aminosav-szekvenciát tartalmazó kötő polipeptidet állítunk elő, ahol az aminosav-szekvencia az analóg lánc kötő specifitásával rendelkezik. Úgy járunk el, hogy az adott immunglobulin könynyű vagy nehéz láncában lévő változó szakaszt meghatározó, de az adott változó szakaszon kívüleső aminosav-szekvenciát meghatározó nukleotidokat nem tartalmazó, az 5 - illetve 3-végeken iniciációs, illetve terminációs kodonnal ellátott kétszálú DNS-szekven196.842 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
