196842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid DNS és az ezet tartalmazó kötő készítmények előállítására
1 2 miatt, emlős szervezetbe injektálva, rövid ideig marad a testben. Ez különösen akkor fontos, ha az rFv veszélyes jelzéssel, például radioizotóppal, nehéz fémmel, citotoxikus szerrel és hasonlókkal ellátva kerül diagnózis vagy terápiás okokból a szervezetbe. A rövid tartózkodási idő előnyös abban az esetben is, ha az rFv-vel in vivo élettani szempontból aktív anyagokat, például hormonokat, enzimeket, felületi receptorokat, limfocitákat vagy más sejteket vagy hasonlókat gátiunk. Az egységes készítmény szabályozott jelzést tesz lehetővé, növeli a konjugátum képességét egy adott hely jelzésére az egyik vagy másik, vagy mindkét Ián con. A homogenitás szabályozott konjugációt tesz lehetővé, pontosan meghatározhatjuk a terápiás aktivitást, könnyen megfigyelhetjük a terápiás hatást, növelhető az eredmények reprodukálhatósága és szabályozhatjuk, illetve könnyen megfigyelhetjük a mellékhatásokat. A találmány szerinti eljárással olyan polipeptid láncok pontos szintézise végezhető el, amelyek összekapcsolva egy előre meghatározott epitopikus helyre nézve kötő pontot tartalmaznak. Az eljárással előállított könnyű és nehéz láncok a ligand jelenlétében vagy anélkül kapcsolhatók össze. A találmány szerinti eljárással lehetőségünk nyílik egy adott célra felhasznált, például radiojódozásra használt tirozin esetén, egy lánc bármelyik végére egy adott aminosav beépítésére. A változó régiókat meghatározó DNS forrásaként monoklónozott hibridotnákat használva a természetes kötőképesség megmarad és a kötő-affinitás széles határok között változtatható. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás egy előre meghatározott ligandra specif! kus immunoglobulin könnyű vagy nehéz láncának vá! tozó szakaszát meghatározó kétszálú, az 5 -végen ini ciációs és a 3 -végen terminációs kodont hordozó dez oxi-ribonukleinsav-szekvenciát tartalmazó — mel> szekvencia az adott változó szakaszon kívüleső ami nosav-csoportokat meghatározó nukleotidoktól men tes - transzformáló kifejeződő vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a fenti láncot meghatározó mRNS-ből az adott könnyű vagy nehéz lánc legalább egyikét kódoló kétszálú cDNS-t állítunk elő, a kapott kétszálú cDNS-ről eltávolítjuk a változó szakaszon kívüleső nukleotid-szekvenciákat, és a változó szakaszt kódoló hasított kétszálú cDNS előállítására az 5 -véget iniciációs, a 3 -véget terminációs kodonnal látjuk el, és a a kapott kialakított kétszálú cDNS-t ennek kifejezésére egy kifejeződő vektorba építjük be. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az iniciációs és terminációs kodonokat in vitro mutagenezissel építjük be. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a beépítés előtt a kétszálú cDNS legalább egy nukleotidját egy, az eredetiből különböző aminosavat meghatározó kodon kialakítására kicseréljük. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eprás,azzal jellemezve, hogy a) kétszálú, egy immunglobulin könnyű vagy egy nehéz láncát meghatározó cDNS-t állítunk elő, ahol mindegyik lánc egy állandó és egy változó szakaszból áll, és ahol a változz szakasz mintegy 95—125 aminosavat tartalmaz, oly módon, hogy az adott láncot kódoló mRNS-t izoláljuk, egyszálú cDNS előállítására reverz transzkriptázzal kezeljük az mRNS-t, DNS polimerázzal az egyszálú cDNS-re komplementer szálat szintetizálunk, amikor a könnyű vagy nehéz láncot meghatározó, kódoló szállal rendelkező $ kétszálú cDNS-t kapunk, amelyben a kódoló szál 5’-3-irányban az immunglobulin vezető szekvenáiáját.a változó és az állandó régiókat meghatározó ONS szekvenciákat tartalmaz, majd a kétszálú cDNS-í klónozzuk, b) a klónozott kétszálú cDNS-ből egy kódoló vagy nem kódoló egyszálú cDNS-t állítunk elő, majd ezután deef vagy cedf sorrendben elvégezzük a c., d., e. és f. lépéseket, c) a vezető és a változó szakaszt meghatározó kódoló szekvencia végpontjára eső nem kódoló szálhoz egy iniciációs helyet meghatározó iniciációs kodont tartalmazó első oligonukleotid prímért hibridizálunk, majd az így kapott első duplexet enzimatikusan kezeljük az első oligonukleotid primer a nem kódoló egyszálú cDNS-re 5 -3 -irányban komplementer meghosszabbítására és ezután N-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú cNDS előállítására a kódoló egyszálú cDNS-t az első oligonukleotid printerre komplementer szekvenciáig a másik irányban leemésztjük, d) a változó és az állandó szakasz végpontját meghatározó DNS-szekvenciához a kódoló szálra egy második, stop anti-kodont tartalmazó oligonukleotid primert hibridizálunk, majd az így kapott második duplex molekulát enzimatikusan kezeljük a második oligonukleotid primer 5 -3 -irányban az adott kódoló szálra komplementer meghosszabbítására és végül C-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú cDNS előállítására az adott kódoló egyszálú cDNS-t a második oligonukleotid primerre komplementer szekvenciáig a másik irányban leemésztjük, e) az így kapott C- vagy N-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú cDNS-t klónozzuk, a C- vagy N-terminálisan meghatározott és kialakított így kapott kétszálú cDNS-t kódoló és nem kódoló szálakra választjuk szét és felhasználjuk a kódoló szálat, ha a d. lépés következik, illetve a nem kódoló szálat, ha a c. lépést végezzük el, végül 0 az előállított N- és C-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú cDNS-t klónozzuk, azután az N- és C-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú, az adott kódoló szekvenciát tartalmazó cDNS-t a transzkripciós és transzlációs szabályozó jelekkel megfelelő orientációban egy kifejeződő vektorba építjük be. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a) egy immunglobulin könnyű vagy nehéz láncát meghatározó kétszálú cDNS előállítására, ahol a láncok mindegyike egy állandó és egy változó régióból áll, és ahol a változó régiók mintegy 95-125 aminosavból állnak, izoláljuk az adott láncot meghatározó mRNS-t, egyszálú cDNS előállítására az mRNS-t reverz transzkriptázzal kezeljük, kétszálú cDNS előállítására DNS poúmerázzal kezeljük az egyszálú cDNS-t, amikor a szálra komplementer szál szintetizálódik és amikor 196.842 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 19
