196842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid DNS és az ezet tartalmazó kötő készítmények előállítására
1 2 olyan kétszálú cDNS-t kapunk, amelynek kódoló szálja az adott könnyű vagy nehéz láncot határozza meg, és ahol a kódoló szál 5 -3-irányban az adott Immunglobulin vezető' szekvenciáját, változó szakaszát és konstans régióját meghatározó DNS-szekvenciát tartalmaz, majd az így kapott kétszál( cDNS-t klónozzuk, b) az adott könnyű vagy nehéz lánc változó szakaszán túleső régiókat meghatározó DNS legalább egy részét a klónozott kétszálú cDNS-t kódoló és nem kódoló szálakra szétválasztva eltávolítjuk, a nem kódoló szálhoz egy első duplex előállítására egy változó régió kifejezését meghatározó iníciációs helyet leíró iníciációs kodont hordozó első oligonukleotíd prímért hibridizálunk, amely első olígonukleotid primer komplementer a vezető szakasz N-terminális részét meghatározó szekvenciára vagy részlegesen komplementer a vezető szakasz és változó régi kapcsolódási pontját meghatározó DNS-szekvenciára, és amely a kapcsolódási pontnál egy nem komplementer iníciációs kodont tartalmaz, az így kapott első duplexet az első oligonukleotid primer 5’-3’-irányban a nem kódoló egyszálú cDNS-re komplementer meghosszabbítására enzimmel kezeljük és a nem kódoló egyszálú cDNS-t N-terminálisan meghatározott kétszálú cDNS előállítására az első oligonukleotid primerre komplementer szekvenciáig leemésztjük, a kapott N-terminálisán meghatárotott és kialakított kétszálú cDNS-t klónozzuk, a kapott N-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú cDNS-t kódoló és nem kódoló szálakra választjuk szét, a kódoló szálhoz egy második duplex előállítására egy stop anti-kodont tartalmazó, de egyébként az adott változó és adott állandó régió kapcsolódási pontján lévő szekvenciára komplementer második oligonukleotidot hibridizálunk, ahol a stop anti-kodon a kapcsolódási helyen van és így az adott változó régió terminális végére egy stop kodon kerül, az így kapott duplexet a második oligonukleotid primer a kódoló szálra komplementer 5’-3-irányú meghosszabbítására enzimmel kezeljük, majd a második oligonukleotid primerre komplementer szekvenciáig a másik irányban leemésztjük a kódoló egyszálú cDNS-t, amikor az adott immunglobulin konstans régióját nem leíró, a változó régió könnyű vagy nehéz láncát kódoló N- és C-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú cDNS-t kapunk, a kapott N- és C-termínálisan meghatározott és kialakított kétszálú cDNS-t klónozzuk, és az N- és C-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú cDNS-t az adott kódoló szekvencia szempontjából a transzkripciós és transzlációs szabályozó jelekkel megfelelő kapcsolatba tartva kifejeződő vektorba vagy plazmidba építjük be. 6, Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első oligonukleotid prímért úgy hibridizáljuk, hogy homoduplexet alkosson az adott nem kódoló szállal az adott vezető szekvencia N-terminális végén. 7. A 4, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első oligonukleotid primert az adott változó régiót meghatározó DNS-szekvencia N-terminális végére egy iníciációs kodont bejuttatva az adott vezető-szekvencia és az adott változó-szekvencia kapcsolódási helyére hibridizáljuk. 8. A 4., 6. és 7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a beépítés előtt az N- és C-terminálisan meghatározott és kialakított kétszálú cDNS-be egy egyedülálló restrikció linkért ligálunk és ezúton kohézív végek előállítására a linkért enzimatikusan hasítjuk. 9. A 4., 6. és 7. igénypontok bármelyike szerinti ePrás, azzal jellemezve, hogy a c) vagy d) lépés legalább egyikében olyan oligonukleotid printerrel hibridizálunk, maley csak részlegesen komplementer az adott cDNS-szálra. 10. A 4 —9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hibridizációs lépéseket követő klónozás során az adott első vagy második oligonukleotíd-szekvenciát hordozó kiónokat szelektáljuk, az adott kétszálú cDNS-t tartalmazó DNS-t izoláljuk és újra klónozzuk az adott kétszálú cDNS-t. 11. Eljárás egy előre meghatározott ligandra specifikus immunglobulin könnyű vagy nehéz lánc változó régiójának legalább egy részét adó aminosav-szekvenciából álló kötő polipeptid előállítására, ahol az aminosav-szekvencia az analóg lánc kötőspecificitásával rendelkezik,azzal jellemezve , hogy az adott láncot meghatározó mRNS-ből a könnyű vagy nehéz láncok legalább egyikét kódoló kétszálú cDNS-t állítunk elő, a kétszálú cDNS-rő! lehasítjuk az adott változó régiókon kívüleső részt leíró nukleotid-szekvenciát, és a változó régiót kódoló meghatározott kétszálú cDNS előállítására a DNS-szekvencia 5’-végébe iniciációs és 3-végébe terminációs kodont építünk be, a kétszálú cDNS kifejezésére kifejeződő vektorba építjük be a kialakított kétszálú cDNS-t és az adott, kialakított kétszálú cDNS-t tartalmazó kifejeződő vektorral egy erre alkalmas gazdasejtet transzformálunk, a transzformált gazdasejtet növesztjük, amikor az adott könnyű és nehéz láncok egyikének kötő polipeptidje kifejeződik, és izoláljuk az adott kötő polipeptidet. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként baktériumot használunk. 13. A 11, vagy 12. igénypont szerinti eljárás, a z - zal jellemezve, hogy az immunglobulinként IgG-t állítunk elő. 14. A 11-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nehéz lánc változó régiójaként D-szekvenciát tartalmazó régiót állítunk elő. 15. Eljárás egy előre meghatározott ligandra specifikus immunglobulint könnyű vagy nehéz láncának változó szakaszát meghatározó kétszálú, az 5’-végen iniciációs éa 3-végen terminációs kodont hordozó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát tartalmazó - mely szekvencia az adott változó szakaszon kívüleső aminosav-csoportokat meghatározó nukleotidoktói mentes — transzfornáló kifejező vektorral transzformált gazdasejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy az említett láncot meghatározó mRNS-ből a könynyű vagy nehéz láncok legalább egyikét kódoló kétszálú cDNS-t állítunk elő, a kétszálú cDNS-ről lehasítjuk az adott változó régión kívüleső részt leíró nukleotid-szekvenciát, és a változó régiót kódoló meghatározott kétszálú cDNS 196.842 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 20
