196842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid DNS és az ezet tartalmazó kötő készítmények előállítására
1 2 zó plazmidokat izoláljuk és a változó régiókat meghatározó szekvenciákat (amelyek a vezető szekvenciákat is tartalmazhatják) PstI restrikciós endonukleázzal kihasítjuk a pBR322 plazmidból és felhasználjuk az rFv polipeptid láncok kifejezésére. A változó régiók kifejezésére a pGMI (pVH253 A trpLEl4l3, Mioznrri és Yanofsky, J. Bact., 133, 1457-1466, 1978) plazmidot használjuk. A plazmidot módosítjuk úgy, hogy Pstl helyet juttatunk be, így lehetőségünk lesz az f-met kodonnal (ATG) együtt változó régiókat meghatározó szekvenciák beépítésére, mégpedig a Shine-Dalgarno szekvenciához képest megfelelő pozícióban. Az. alábbi oligonukleotid szekvenciát állítjuk elő: AGCTGCAGCTTTCGTT 10 jug pGMI DNS-t egyik szálán EcoRI endonukleázzal (Boehringer Manheim, 1000 egység) hasítunk 1 ml 100 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH 7,2), 50 mM nátrium-kloridot, 3 mM magnézium-acetátot, 0,017« NP-40-et és 150 Mg/ml etidimn-bromidot tartalmazó reakcióé légyben, 1 órán át 37 °C hőmérsékleten. 10 mM EDTA (végkoncentráció) adagolása után 3x10 ml vízzel telített izobutanollal, majd 1 alkalommal fenol és kloroform 1:1 arányú elegyével, kétszer éterrel, végül egyszer izobutanollal extraháljuk az elegyet a térfogat 0,1 ml-re csökkentése érdekében. 0,5 ml térfogatú Sephadex G-25 oszlopon át centrifugál va sómentesítjük az oldatot, majd etanollal kicsap juk a DNS-t. 5 pg hasított DNS-t 40 egység exonuk leáz Ill-mal (BRL) inkubálunk 20jul, 10 mM trisz-hidrogén-kloridot, pH 7,5, 2 mM magnézium-kloridot, és 1 mM 0-merkapto-etanolt tartalmazó reakcióelegyben. Az inkubálást 37 °C hőmérsékleten 90 percen át végezzük. Adagolással 15 mM trisz-hidrogén-kloríd, pH 7,5, 7 mM nátrium-klorid, 7 mM magnézium-klorid és 7 mM ditio-treitol koncentrációt állítunk be. 20 egység bakteriális alkalikus foszfatázt (BBL)és 5 egység Hinfl-et (BRL) adagolunk, maid 30 percen át emésztünk, 37 °C hőmérsékleten. Adagolással 10 mM EDTA koncentrációt állítunk be, kétszer fenol és kloroform 1:1 arányú elegyével extTaháljuk, az extrakciót éterrel megismételjük és 0,5 ml vízzel kiegyenlített Sephadex G-25 gyantával, centrifugálás közben sóméntesítjük az elegyet. Az így előállított köralakú egyszálú DNS nagy részét 50 pM mennyiségű, az előzőekben megadott 5’-foszforilezett olígonukleotiddal keverjük a Pstl hely bejuttatására. A reakciót 38 Ml, 200 mM nátrium-kloridot, 13 mM trisz-hidrogén kloridot, pH 7,5, 9 mM magnézium-acetátot és 20 mM 0-merkapto-etanolt tartalmazó reakcióelegyben végezzük. A reakcióelegyet 30 percen át forraljuk, majd azonnal 0 °C-ra hűtjük. Ezután az alábbi összetételű elegyet adagoljuk: összesen 4 Ml a 4 mM-os négy dNTP-ből, 0,5 ;ul 100 mM-os ATP, 3 m! (3 egység) DNS-polimeráz (Klenow-fragmens) éso4 mí (10 egység) T4 DNS-ligáz. Egy éjszakán át 12 °C hőmérsékleten inkubáljuk az E. coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformánsokat tenyésztjük, izoláljuk és folt-hibridizációs módszerrel, izotóppal jelzett P32-oligomert használva analizáljuk az új Pstl helyet tartalmazó hasított szekvenciát hordozó kiónok kimutatására. A hasított pGMi-et izoláljuk és Pstl endonukleázzal részlegesen emésztjük és a fentiekben megadottak szerint előállított, a könnyű és nehéz láncok változó régióit meghatározó DNS-szekvenciákat egyenként, a fentiekben megadottak szerint eljárva beépítjük a hasított helyre, amikor két olyan plazmidot kapunk, amelyek könnyű (pGMIL), illetve nehéz pGMIL) láncot kódoló DNS-szekvenciákat tartalmaznak. A kapott plazmidokkal E. coli HB101 sejteket transzformálunk, és a könnyű és nehéz láncok változó szakaszait leíró szekvenciákat megfelelő orientációban tartalmazó kiónokat restrikciós térképezéssel azonosítjuk és tisztítjuk. A könnyű és nehéz láncot felismerő antiszérumot az adott lánc antigénként való felhasználásával állítjuk elő, az antiszérumot izoláljuk és ismert módon kovalensen kapcsoljuk egy Sepharose gyantához (March és munkatársai, Anal. Biochem., 60, 149-152, 1972), a terméket affinitás kromatográfiához használjuk fel. A transzformánsokat milliliterenként 1CT sejtet tartalmazó sejtsűrűségig tenyésztjük, majd centrifugálással összegyűjtjük. Az üledéket 50 ß\, alábbi öszszetételű elegyben szuszpendáljuk: 50 mM trisz-hidrogén-kloríd, pH 8,0, 50 mM EDTA, 15% szacharóz, 1 mg/ml lizozim, 0,5% NP40. 30 percen át 0 °C hőmérsékleten tartjuk a szuszpenziót, majd 10 ß\ 150 mM-os trisz-hidrogén-kloridot, pH 7,5, 280 mM magnézium-kloridot, 4 mM kalcium-kloridot és 1 Mg DNázt adagolunk hozzá, és ezt követően 15 percen ál 12 000 g-n centrifugáljuk. A felülúszót az üledékről leszívjuk és izoláljuk a fehérjéket. A felülúszót trisz-hidrogén-klorid, pH 7,5, oldattal kiegyenlített, 0,15 ml térfogatú immunszorbens oszlopon engedjük át. Az rFv könnyű és nehéz láncait 2,5 pH-jú mólos ecetsavval eluáljuk, az eluátumokat összegyűjtjük és 0,1 M nátrium-lűdroxid oldattal 0 °C hőmérsékleten pH 5,5-re semlegesítjük. 3x100 térfogat nátrium-acetát pufferral, pH 5,5, szemben dializáljuk az eluátumot, majd a dialízist 3x100 térfogat pH 7-es PBS-sel szemben megismételjük. Ha a renaturált könnyű és nehéz rFV láncok azonos forrásból származnak, úgy atokat tovább tisztíthatjuk az rFV komponenseket tartalmazó eluátumok egyesítésével és DNP-affinitás kromatográfiával. (A megadott példában kapott nehéz és könnyű láncok különböző forrásból származnak, így ezt a lépést nem kell elvégeznünk). A DNP-affinitás oszlopot és az eljárás Kooistra és Richard írja le. (Biochem., 17, 345- 351, 1978). A kötött rFV-t 1 mólos ecetsavval eluáljuk, majd a fentiek szerint végzett egymást követő dialízisekkel renaturáljuk. Azonkívül a szulfhidrilcsoportok megőrzésére jód-acetamiddal kezelünk Kooistra és Richards (1. fent) szerint eljárva. A találmány szerinti eljárással olyan protein komplexekből álló homogén készítményt állítunk elő, amely előre meghatározott heptan hellyel erős kötőképességgel rendelkező, két peptid láncból álló komplexet képez. A két lánc egy rFv-t alkot, amely specifikusan kapcsolódik egy adott ligandhoz, mivel a természetben előforduló immunglobulint utánoz. A konstans régiók nélkül az előállított rFv csökkent ímmungenecitással rendelkezik, és nem tartalmaz adott felhasználási területen, például a komplement fixáláskor előnytelen funkciókkal rendelkező peptid szekvenciákat. A találmány szerinti rFv célra, diagnózisra és terápiás célokra használható fel. A készítmény homogén és ezért mindig reprodukálható immungenetikus értékkel rendelkezik. A termék csökkent molekulasúlya 196.842 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 18
