196842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid DNS és az ezet tartalmazó kötő készítmények előállítására
1 2 0,5 pg egyszálú DNS-hez 15 pMól 5 -foszforilezett, fentebb az a-nál és b-aél leírt oligonukleotidot adunk 38 pl 200 mM nátrium-kloridot, 13 mM trisz•hidrogén-kloridot (pH 7,5) 9 mM magnézium-acetátot és 20 mM (3-merkapto-etanolt tartalmazó elegyben, majd 3 percen át forraljuk és azonnal lehűtjük. A reakcióelegyhez I pl, 4-4 mM koncentrációban a négy dezoxi-nukleotid-trifoszfátot, 0,1 pl, 100 mM adenozin-trifoszfátot és 1 pl (1 egység) DNS polimeráz 1 Klenow-fragmenst tartalmazó oldatot (Boehringer Mannheim)adunk, _így az 5 -vezető szekvenciát meghatározó szálakat és a kódoló szekvenciát vagy éppen a változó régió kódoló szekvenciáját szintetizáljuk, és ugyanakkor a 3 -5 -exonukleáz aktivitással leemésztjük a templát nem kódoló szálának 3 -irányában az egyszálú DNS-szekvenciát. A szintézis eredményeképpen a vezető szekvenciát tartalmazó szálra olyan homoduplexet kapunk, amely kódolja a vezető szekvenciát és a könnyű és nehéz láncok változó szakaszait. A termék tompa végű, továbbá a kódoló szál 5 -végénél egy íniciációs kodont tartalmaz leolvasási fázisban a további DNS szekvenciával. A láncok változó régióit és a vezető szekvenciát meghatározó tompa végű duplexhez megfelelő foszforilezett linkereket, például PstI linkereket használva restrikciós linkereket ligálunk T4 polinukleotid ligázt és a gyártó által javasolt reakciókörülményeket használva. A pBR322 vektort PstI enzimmel hasítjuk, amikor kohézív végeket kapunk, ezekkel pedig a módosított cDNS-hez kapcsoljuk. Mindegyik cDNS-t hozzákapcsoljuk a komplementer végekkel rendelkező lineáris pBR322-höz. A reakcióelegyként használt pufferban (Steinmetz és munkatársai, Cell, 24, 125-134, 1981) azonos moláris mennyiségű vektort és cDNS-t reagáltatunk és az őszszekapcsolt DNS-t közvetlenül használjuk fel transzformáláshoz. Az E. coli HB101 (Boyer és Roulland-Dussiox, J. Mól. Bioi., 41,459-472,1969)törzset egy éjszakán át növesztjük L-táptalajban, míg a tenyészet milliliterenként 2x10® sejtet tartalmaz. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük (Sorval SS34 rotor, 80 000 ford/perc, 4 °C, 5 perc) és 0,5 térfogat 10 mM-os hideg kalcium-klcriddal mossuk. Az üledéket 0,5 térfogat hideg, 30 mM-os kalcium-kloridban szuszpendáljuk. 20 percen át jégfürdőben tartjuk a sejteket, majd ismét centrifugáljuk és 0,1 térfogat 30 mM hideg kalcium-kloridban szuszpendáljuk. Ezután 0,20 ml szuszpenziót adunk 0,1 ml, az elkészített plazmidot tartalmazó 30 mM-os kalcium-klorid oldathoz és 16 percen át jégfürdőben inkubálunk. Ezután mindegyik transzformációs elegyet 75 másodpercen át 42 °C hőmérsékleten tartjuk, majd 5 ml L-táptalajt adagolunk. A transzformált tenyészeteket 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután M-9 szilárd halmazállapotú minimal táptalajon 10 pg/ml tetraciklin jelenlétében növesztjük a transzformánsokat. Az agaron növekvő telepeket 40 pg/ml ampicillint tartalmazó agaros minimal táptalara replikázzuk. Az ampicillinre érzékeny és a tetraciklinre rezisztens sejteket a megfelelő cDNS-t tartalmazó plazmid jelenlétére vizsgáljuk. A kiválasztott kiónokat 18 órán át 2 ml megfelelő táptalajon növesztjük. 0,5 /ti alikvót mintát 1,5 ml-es Eppendorf csőbejuttatunk a plazmid extrahálására. A kísérleteket szobahőmérsékleten végezzük, kivéve, ha másként nem adjuk meg. A centrifuracsöveket 15 percen át centrifugáljuk, a felülúszót finoman elkülönítjük és a sejteket 100 pl, 2 mg/ml lizozimot, 50 mM glükózt, 10 mM EDTA-t és 25 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH 8,0) tartalmazó lizozim oldatban erőteljesen szuszpendáljuk. 30 percen átO °C hőmérsékleten inkubálunk, majd 200 pl alkalikus SDS oldatot (0,2 N nátrium-hidroxid és 1% nátrium-dodecil-szulfát) adagolunk, és ezután enyhén vortexeljük a szuszpenziót. 5 percen át 0 °C hőmérsékleten tartjuk a csöveket, majd 150 pl 3 M-os nátrium-acetát oldatot (pH 4,8) adagolunk. Néhány másodpercen át a csövek forgatásával enyhén keverjük az oldatot, majd 16 percen át 0 °C hőmérsékleten tartjuk. 5 percen át centrifugáljuk az elegyet, majd 0,4 ml felülúszót elkülönítünk, egy másik centrifugacsőbe juttatjuk, 1 ml hideg etanolt adunk hozza és 30 percen át -20 °C hőmérsékleten tartjuk. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük (2 percnyi centrifugálás) és a felüúszót leszívjuk. Az üledéket 100 pl 0,1 M nátrium-acetátban szuszpendáljuk, 200 pl etanolt adagolunk és 10 percen át -20 °C hőmérsékleten tartjuk. Ezután centrifugálással ismét összegyűjtjük a csapadékot és 50 pl vízben oldjuk. Az in vitro mutagenezishez lényegében a fenti eljárást használjuk. A primer repair szintézissel csak egy homoduplexet készítünk, az in vitro mutageneziskor eredetileg egy heteroduplexet alakítunk ki, ami transzformációt és klónozást követően két heteroduplexet alakít ki: az eredeti génszekvenciát és a módosított vagy hasított génszekvenciát. Az utóbbiban a változás az oligomerben meghatározott szekvenciában is bekövetkezik. Ahogy azt a c. és d. rekcióvázlat során megadtuk, olyan oligomert állítunk elő, amely a változó régiókat meghatározó kódoló szekvencia N-terminális végén f-metiont meghatározó ATG iniciációs kodont tartalmaz. A kapott plazmid DNS-t a fentiek szerint eljárva izoláljuk és ismét transzformációt végzünk. A transzformánsokat 2 ml tenyészetben növesztjük a plazmid izolálására. A második klónozásból származó egyetlen transzformáns telepből izolált DNS-t nitrocellulóz szűrőn szűrő hibridizációs módszerrel vizsgáljuk (Wallace és munkatársai, Nucleic Acids Research, 6, 3542-3556, 1979) a próbát P32-radioizotóppal jelzett oligomerpel végezzük, amit a mutagenezishez használtunk. így biztos, hogy a megfelelő hasított cDNS homoduplexet izoláljuk. A hasított szekvenciát tartalmazó kiónokat izoláljukés a kódoló szál 3’-végének további kezelésére izoláljuk a plazmid DNS-t. A változó szakaszokat meghatározó cDNS PstI enzimes kezeléssel kihasítható. Az előzőekben ismerteti in vitro mutagenezis megismétlésével, ahol egy ATG (start) kodont juttatunk be a kész polipeptid N-termlnális aminosavat leíró kodon elé, egy stop kodont juttatunk be a változó régiók C-terminális végéhez. Az előzőekben megadottak szerint eljárva oligonukleotidokat állítunk elő, amelyek komplementer szekvenciával rendelkeznek a cDNS változó régióit leíró kódoló (sense) száljával. Az alábbiakban megadjuk az oligonukleotidokat és a stop kodon beépítési szkémáját a változó szakaszok végéhez. Az e. pontban ismertetjük a stop kodon beépítését a könnyű láncba, míg a stop kodon be-196.842 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 16
