196842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid DNS és az ezet tartalmazó kötő készítmények előállítására
1 2 0,25 mólos EDTA (pH 8,0) és 20 pl 10%-os SDS adagolásával leállíljuk a reakciót. A protein eltávolítására vízzel telített fenol és kloroform (I :l) eleggyel extraháljuk az. oldatot, majd etanolla! kicsapjuk a DNS-t. A KpnI endonukleázzal előállított végekhez 60, de nem több, mint 80 dT-csoportot kapcsolunk (végenként) borjú tbymus terminális dezoxi-nukleotidil-transzferázz.al. Úgy járunk el, hogy 0,2 ml reakcióelegy előállítására 140 mM nátrium-kakodilátot 30 mM trisz.-hidrogén-kloridot (pH 6,8), I mM kalcium-kloridot, 0,1 mM ditio-treitolt, 0,25 mM DTTP-t, KpnI endonukleázzal emésztett DNS-t és 400 egység terminális dez.oxi-nukleotidil-transzferázt tartalmazó oldatot készítünk. 30 percen át 37 °C hőmérsékleten végezzük a reakciót, majd 20 pl 0,25 mólos,EDTA (pH 8,0) és 10 jul 10%-os SDS adagolásával leállítjuk, a DNS-t pedig fenol és kloroform 1:1 arányú elegyével végzett extrakciókat követően etanollal kicsapjuk. 17 egység Hpal endonukleázzal emésztjük az. izolált DNS-t, az emésztést 0,2 ml, 10 mM trisz-hidiogcn-kloridot (pH 7,4), 10 mM magnézium-kloridot, 20 mM kálium-kloridot, I mM ditio-treitolt és milliliterenként 0,1 mg BSA-t tartalmazó reakcióelegybcn végezzük 5 órán át, 37 °C hőmérsékleten. A pBR322 DNS replikációs origóját és az ampicillin rezisztenciát meghatározó gént tartalmazó nagy DN8 fragmens 1% agarózt tartalmazó gélen elektroforézist végezve tisztítjuk, a gélről Vogelstein és Gillespie (PNAS USA, 76, 615-619, 1979) üvegporos módszerének módosított változatával izoláljuk a DNS-t. A (1T-végű DNS-t oligo-dA-cellulóz oszlopra adszorbeálva és eluálva az alábbiak szerint tovább tisztítjuk: a DNS-t 1 mM EDTA-t és 1 M nátrium-kloridot tartalmazó 10 mM-os trisz-hidrogén-klorid (pH 7,3) pufferbcn oldjuk, 0 °C hőmérsékletre hűtjük, és 0,6x2,5 cm méretű, 0 °C hőmérsékleten hasonló pufferral kiegyensúlyozott oligo-dA-cellulóz oszlopra öntjük az oldatot. 0 °C-on hasonló pufferral mossuk az oszlopot és szobahőmérsékleten vízzel eluáljuk. A 14 pg-nyi eiuált DNS-t etanollal kicsapjuk és 10 mM trisz-hidrogén-klorid (pH 7,3 és 1 mM EDTA elegyének 100/rl-ében oldjuk. Az oligo-dG-végű linker DNS előállítására 100 Mg pBE322-SV40 (térképegység 0,1941,32) DNS-t 120 egység Pstl endonukleázzal emésztünk 0,2 ml alábbi összetételű reakcióelegyben: 6 mM trisz-hidrogén-klorid (pH 7,4), 6 mM magnézium-klorid, 6 mM 2-merkapto-etanol, 50 mM nátrium-kiorid és 0,1 mg/ml NSA. A reakciót 1,5 órán át 37 °C hőmérsékleten végezzük, majd a reakcióé legyet fenol és kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk és a DNS-t alkohollal kicsapjuk. Ezt követően a végekhez 10-15 dG-csopormt kapcsolunk 50 fül az előzőekben megadott öszszetételű, de a dTTP helyett 0,1 mM dGTP-t tartalmazó reakcióelegyben 60 egység terminális dezoxi-nukleotidil-transzferázzal. A reakciót 20 percen át 37 °C hőmérsékleten végezzük, majd fenol és kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk az elegyet, a DNS-t etanollal kicsapjuk és 50 mI, alábbi összetételű reakcióelegyben 50 egység Hind III endonukleázzal hasítjuk 20 mM trisz-hidrogén-klorid (pH 7,4), 7 mM magnézium-klorid, 60 mM nátrium-kiorid és 0,1 mg/ml BSA. A kisméretű, oligo-dT-végű linker DNS-t 1,8% agarózt tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk és az előzőekben megadottak szerint izoláljuk. Előállítjuk az alábbi reakcióelegyet (térfogata 10 n 1 50 mM Trisz-hidrogén-klorid (pH 8,3), 8 mM magnézium-klorid, 30 mM kálium-klorid, 0,3 mM ditio-treitol, 2 mM DATP, dTTP, dGTTP és P3J-dCTP (850 beütés/perc/pmol), 0,2 Mg ntRNS (körülbelül 2-3 szoros feleslegben a primer végekhez képest), 1,4 Mg vektor primer DNS (0,7 pmol primer vég) és 5 egység reverz transzkriptáz. (A poliA mRNS mólaránya a vektor primer DNS-re számítva 1,5:1 és 3:1 közötti). A cDNS szintézisét a reverz transzkriptáz adagolásával indítjuk meg és 37 °C-on 20 percen át folytatjuk Ekkor a dCTP beépülés csökken és a primer több, mint 60%-a felhasználódott a cDNS szintéziséhez. 1 Ml 0,25 M EDTA (pH 8,0) és 0,5 m1, 10%-os SDS adagolásával leállítjuk a reakciót, az elegyet fenol és kloroform 1 :l arányú elegyével vortexeljük, majd centrifugáljuk. A vizes fázishoz 10 m1 4 M ammóniunr-acetátot és 40 pl etanolt adunk, száraz jég között 15 percen át hűtjük, a hűtés közben kivált nem reagált dezoxi-nuklcozid-triofoszfátok oldására enyhén rázzuk, majd Eppendorf mikrofugában 10 percen át centrifugáljuk. A csapadékot 10 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH 7,3) és 1 mM EDTA-t tartalmazó elegy 10 Ml-ében oldjuk, az oldathoz 10 pl 4 mólos amrnónium-acetát oldatot keverünk és 40 pl etanollal újra kicsapjuk, majd etanollal mossuk a csapadékot. A cDNS: mRNS plaz.midot tartalmazó csapadékot 15 Ml, 1 mM kobalt-kloridot, 0,1 mM ditio-treitolt, 0,2 Mg poli-A-t, 66 mM P1J-dCTP-I (600 beütés/percpmói) és 18 egység terminális dezoxi-nukleotidil-t -transzferázt tartalmazó 6,8 pH-jú 140 mM nátrium-kakodilát-30 mM trisz-hidrogén-klorid elegyben oldjuk. A reakciót 37 °C hőmérsékleten végezzük 5 perc' át, amikor 10 15 dCMP kötődik a molekulák végéhez. A reakciót 1,5 m1 0,25 M EDTA (pH 8,0) és 0,75 mI 10%-os SDS adagolásával állítjuk le. 15 m1 fenol-kloroform eleggyel (1:1) extraháljuk az elegyet, és 15 Ml 4 M-os ammónium-acetáttal keverjük, majd 60 Ml etanollal kicsapjuk, és ismételten kicsapjuk, és végül a csapadékot etanollal mossuk. A csapadékot 20 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH 7,4), 7 mM magnézium-kloridot, 60 mM nátrium-kloridot és 0,1 mg/ml BSA-t tartalmazó, 10 m! térfogatú pufferban oldjuk, majd 2,5 egység HindiII endonukleázzal emésztjük 37 °C hőmérsékleten, 1 órán át. 1 Ml 0,25 M EDTA (pH 8,0) és 0,5 m! 10%-os SDS adagolásával leállítjuk a reakciót, majd fenol és kloroform-acetátot adagolunk és a DNS-t 40 m1 etanollal kicsapjuk. A csapadékot etanollal mossuk és 10 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH 7,3) és 1 mM EDTA-t tartalmazó elegy 10 Miében oldjuk, végül 3 mI etanolt adunk hozzá, hogy -20 “C hőmérsékleten tárolva ne fagyjon meg. 0,02 pmól (1 mO Hindlll endonuklezázzal emésztett oligo-dC-végű cDNS: mRNS plaz.midot 10 m1, alábbi összetételű elegyben inkubálunk 2 percig, 65 °C-on: 10 mM trisz-hidrogén-klorid (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 M nátrium-kiorid és 0,04 pmól oligo-dG-végű linker DNS (ez a mennyiség egyszeres moláris felesleget jelent a kétszálú cDNS. mRNS-re és a Hindin endonuklezázzal való fentiek szerinti emésztést követően kapott fragmensre számítva). Az inkubálást 30 percen át 42 °C hőmérsékleten folytatjuk, majd 0 °C-ra hűtjük. 10 Ml elegyhez annyi alábbi öszszetételű elegyet adunk, hogy térfogata 100 Ml legyen: 20 mM trisz-hidrogén-klorid (pH 7,5), 4 mM magnéziumklorid, 10 mM ammónium-szulfát.O,! M kálium-196.842 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
