196842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid DNS és az ezet tartalmazó kötő készítmények előállítására
1 2 196.842-klorid, 50 Mg/ml BSAésO,! mM ß-NAD. Azelegyhez 0,6 Mg E. coli DNS-ligázt adunk és egy éjszakán át 12 °C hőmérsékleten inkubálunk. A kétszálú cNDS; mRNS szálának kicserélésére a ligációs elegyhez 40-40 pM-t adunk a négy dezoxi-nukleitid-trifoszfátból, továbbá 0,15 mM ß-NAD-ot, 0,4 Mg további E.coli DNS-ligázt, 0,3 Mg E. coli DNS-polimeráz 1-et és 1 egység E. coli RNáz H-t adagolunk. A 140 Ml térfogatú reakcióelegyet 12 °C-on, majd szobahőmérsékleten inkubáljuk 1-1 órán át, amikor létrejön a repair szintézis éa a Poll katalizált nick-transzláció. A reakciót 0,9 ml hideg, 10 mM-os trisz-hidrogén-klorid (pH 7,3) adagolásával leállítjuk és 0,1 ml alikvótokat tárolunk 0 C hőmérsékleten. A transzformációt Cohen és munkatársai által leírt (PNAS USA, 69, 2110-2114, 1972) némileg módosított módszerét használva végezzük el. Az E. coli KI 2 HB101 törzset 37 °C hőmérsékleten növesztjük 20 ml standard ^táptalajban. A növesztést addig folytatjuk, míg X 600 hullámhosszon az ODO,5. Centrifugálással összegyűjtjük a sejteket, 10 ml, 50 mM kalcium-kloridot tartalmazó 10 mM-os trisz-hidrogén-kloridban (pH 7,3) szuszpendáljuk és 5 percen át 0 °C hőmérsékleten centrifugáljuk. A sejteket 2 ml fenti összetételű pufferban szuszpendáljuk és 5 percen át 0 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 0,2 ml sejtszuszpenziót 0,1 ml DNS-oldattal keverünk, és 15 percen át 0 °C hőmérsékleten inkubálunk. 2 percig 37 °C, majd 10 percen át szobahőmérsékleten tartjuk a szuszpenziót, majd 0,5 ml standard L-táptalajt adagolunk hozzá, 30 percen át 37 °C-on inkubálunk és ezt követően 50 Mg/ml ampicillint tartalmazó agarlemezeken lévő nitrocellulóz szűrőkre szélesztjük. 12- 24 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubálunk, majd az E.coli transzformánsokat Grunstein és Hognessin situ telephibridizációs módszerével megvizsgáljuk, tartalmaznak-e könnyű és nehéz láncot meghatározó cDNS-t. A három replika nitrocellulóz szűrőkorongon többezer transzformáns nő, ezeket lúggal lizáljuk, és az előzőekben megadottak szerint próbákkal hibridizáljuk az immunglobulin láncok nehéz és TCA GGA CTC AGC Gin Ile Phe Gly Phe CAG ATT TTT GGC TTC Thr Arg Cys Asp ACC AGA TGT GAC Ser Ser Leu Ser Alá TCC TCC TTA TCT GCC Leu Thr Cys Arg Alá CTC ACT TGT CGG CCA Leu Asn Trp Leu Gin TTA AAC TGG CTT CAG Lys Arg Leu Ile TVr AAA CGC CTG ATC TAC Gly Val Pro Lys Arg GGT GTC CCC AAA AGT könnyű szakaszainak konstans régióit keresve. Az immunglobulin könnyű és nehéz láncait meghatározó 5 géneket tartalmazó kiónokat azonosítjuk. A pozitív hibridizációs jelet adó telepeket egy liter, 50 Mg/ml amplicillint tartalmazó L-táptalajban tenyésztjük és a plazmid DNS-t ismert módon izoláljuk (Gunsalus és munkatársai, J. Bact., 140, 106-113, 1979). Az előzőekben megadottak szerint eljárva lizáljuk a sejteket, a lizátumot centrifugáljuk és a tiszta oldatot azonos térfogatú vízzel hígítjuk. Milliliterenként 50 Mg RNáz A-t adagolunk, majd egy órán át 37 °C hőmérsékleten inkubálunk. Ezután 0,3 térfogat, TE-pufferral (10 mM trisz-hidrogén-klorid, pH 7,9 1 <r mM EDTA) telített fenollal extraháljuk az oldatot, ' majd 4 °C hőmérsékleten 10 percen át 16 0000 g-n centrifugáljuk. A vizes fázist elkülönítjük, 1 M végkoncentrációra nátrium-kloriddal egészítjük ki és 2 térfogat etanollal kicsapjuk a DNS-t. Több órán át -20 'T-on tartjuk a szuszpenziót, majd 10 000 g-n, 20 4 °C hőmérsékleten 20 percen át centrifugálva elkülönítjük a kivált DNS-t. A cDNS kiónokat restrikciós enzimekkel térképezzük, illetve szekvencia-analízist végzünk ismert módszerekkel. A kapott restrikciós térkép segítségével a változó szakaszokat meghatározó cDNS olymódon 25 manipulálható, hogy az klónozható és kifejezhető lesz. A fentiekhez Maxam és Gilbert (Methods Enzymo!„ 65, 499-560, 1980), illetve Sanger és munkatársai, (J. Mól. Bioi., 143, 161-178, 1980) módszereit használjuk a könnyű és nehéz láncok teljes változó régióit és a vezető szekvenciákat meghatározó cDNS J kiónokat. izoláljuk, szekvenáljuk és manipuláljuk például a MOPC41 K-láncát (könnyű lánc) és a myeloma SÍ07 nehéz láncát. Az alábbiakban megadjuk a MOPC41-K-láncának 35 szekvenciáját, ahol a vezetőt, a változó régiót és konstans szakaszt pontokkal választottuk el. A konstans szakasznak csak az első tizenhat amínosavát jelöljük (Nature, 280, 370-375, 1979, Seidman és munkatársai). Met ASP Met Ala Pro Ala ATG GAC AGG GCT CCT GCA Leu Leu Leu Leu Phe Gin Gly TTG TTG CTC TTG TTT CAA GGT lie Gin Met Thr Gin Ser Pro ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser TCT CTG GGA GAA AGA GTC AGT Ser Gin Asp Ile Gly Ser Ser AGT CAG GAC ATT GGT AGT AGC Gin Glu Pro Asp Gly Thr Ile GAG GAA CCA GAT GGA ACT ATT Alá Thr Ser Ser Leu Asp Ger GCC ACA TCC AGT TTA GAT TCT Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly TTC AGT GGC AGT AGG TCT GGG 12
