196788. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szubsztituált dihidro-piridin származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 2 Megfigyeljük u vérnyomásban, illetve a pulzusszámban beálló minimális változásokat. A szívstimuláló hatás in vivo vizsgálata (cber kutyákon) Az l. példa szerinti vegyület intravénásán adagolva a bal ventrikuláris dp/dt max értékét éber kutyákban 0,02 mg/kg-nál kisebb mennyiségben növeli. Orális adagolás esetén 0,05 mg/kg vagy ennél kisebb mennyiség beadása után lép fel pozitív inotróp hatás. A pozitív inotróp hatás legalább 3 órán át megmarad (a mérés maximális időtartama) a vérnyonrásljan illetve a pulzusszámban fellépő változás nélkül. így az említett vegyület különösen előnyös a szívizomerő /pulzusszám viszony szelektivitásának a szempontjából. Az amrinon sokkal kevésbé aktív és rövidebb hatástartamú. A foszfodiészterázok gátlása Macskák szívéből származó három ciklusos nukleotid foszfodiészteráz-aktivitás csúcsot [PDE (1. csúcs), PDE (II. csúcs) és PDE (III. csúcs)] DEAE Sepharose CL-6B oszlopon (dietil-amino-etil-cellulóz, szemcseméret 45-165 mikron) kromatográfiásan elválasztunk. A Sepharose a Pharmacia Fine Chemicals Inc. lajstromozott védjegye. A macskaszív-homogenizátumból nagy sebességű centrifugálással kapott felülúszó részt (2 g szövet 20 ml 20 mrnólos PIPES-oldatban /piperazin-N,N’-bisz(2-etánszulfonsav), 50 mmól nátrium-acetátban, pH 6,5) a homogenizáláshoz alkalmazott pufferral egyensúlyba hozott 15x1,5 cm métetű DEAE-Sepharose oszlopra visszük. A PDE aktivitásokat 20 mrnólos PIPES-oldatban oldott 0,05-1 'mól nátrium-acetát gradienssel eluáljuk. Három nagy csúcsot kapunk, amelyeknek a jellemzői a következők PDE (I. csúcs) - 0,15 m nátrium-acetáttal eluálva Szubsztrá tűm 50 /ag/ml 'Kin-(jiM) calmodulin (+=adagoljuk) Relatív ymax ciklusos AMP , _ 0,5 1 ciklusos GMP — 1,8 1,1 ciklusos AMP + 0,7 6,3 cildusos GMP + 1,4 7,2 PDE (II. csúcs) -- 0,3 m nátrium-acetáttal eluálva Szubsztrá tűm Km (/uM) Reiatív Vmax ciklusos AMP 6 1 ciklusos GMP 28 0,2 PDE (III. csúcs) — 0,5 m nátrium-acetáttal eluálva Szubsztrátum KmOiM) Relatív Vmax ciklusos AMP 0,6 1 ciklusos GMP 2,9 .0,4 PDE (I. csúcs) nagy affinitású a ciklusos AMP-vel és a ciklusos GMP-vel szemben és jellemzője, hogy Ca2+/kalmodulin komplexxel aktiválható. PDE (II. csúcs) viszonylag kis affinitású mind a ciklusos AMP-vel, mind a cildusos GMP-vel szemben és nem aktiválható Ca2+/kalmoduIin komplexszel. PDE (III. csúcs) nagy affinitású a ciklusos AMP-vel szemben. Képes a GMP-t is hidrolizálni, bár előnyös szubsztrátúrna a ciklusos AMP . Ca2+/kalmodulinnal nem aktiválható. Enzlmvizs gálát Az enzimet 37 °C hőmérsékleten 4-30 percig vizsgáljuk 50 ml Tris-t és 5 mmól MgCl2-t tartalmazó oldatban 7,5 pH-értéknél 3H ciklusos nukleotiddal (4xl05 szétesés min'1) és 14C nukleotid-5’-monofoszfáttal (3x103 szétesés min'1) történő inkubálással. A vizsgálatot forralással leállítjuk és a 3H 5’-monofoszfátot boronát oszlopon elválasztjuk a szubsztrá tűmtől (Davis, C. W. és Daly, J. W. (1979) J. Cyclic Nucleotide Res., 5, 65-74). A reakcióelegyet 0,5 ml, 100 mmól nátrium-kloridot tartalmazó 100 mrnólos HEPES-oldattal (N-2-/hidroxi-etil/-piperazin-N’-2-etánszulfonsav hígítjuk 8,5 pH-érték mellett, majd az oszlopra visszük. Az oszlopot alaposan mossuk a megadott pufferrel és az 5-nukleotidot és 6 ml 0,25 m ecetsav-oldattal eluáljuk. A 14C meghatározása alapján a termék mintegy 80%-os tisztaságú. A vizsgálatok eredményei lineárisak az inkubációs idővel és az enzim-koncentrációval az alkalmazott körülmények között. Az IC50-értékek számítása Az IC50 értéket (az az inhibitor-koncentráció, amely az 50%-os gátló hatás eléréséhez szükséges) a PDE (III. csúcs) esetén az enzimet 1 jam cildusos AMP-vel inkubálva 0,lxIC5O és 100xIC5o közötti inhibitor-koncentrációkkal határozzuk meg. A vegyület példaszáma IC50xlO'6 mól 1 0,41 2 5,09 3 3,99 4 1,59 5 4,33 6 1,75 7 0,54 8 1,32 9 1,25 10 0,44 11 2,64 13 6,60 14 2,26 16 0,23 17 2,58 Amrinon 5 j g~ Milrinon 2,2 Specifikusság A példákban bemutatott vegyületek 10*4 mól koncentrációig nem fejtenek ki gátló hatást PDE (I. csúcs)-vel való inkubálás esetén és ugyancsak nem mutatnak gátló hatást, illetve a gátlás rendkívül gyenge PDE (II. csúcs)-nél, azaz szelektív PDE (III. csúcs)-gátlók. Ez a specifikusság arra utal, hogy a vegyület-196.788 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
