196745. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunstimuláns és citosztatikus hatású N-(aminoimino-metil) izotiurónium származékok előállítására
1 2 196 745 Loukocita migráció A leukociták spontán (random) migrációját agaróz mikrocseppekből McCoy és mtsai (1977) mód- 5 szerével mértük némi módosítással (Kalmár, és Gergely 1982). Röviden: 4xl05 leukocitát tartalmazó 2 ml-es agaró/. (0,2%) cseppecskéket Greiner (NSZK) migrációs lemezekre helyeztünk. TC 199 tápfolyadékot adtunk hozzá és légmentesen lezártuk. 24 óra múlva U mértük a migrációs területeket sztereó mikroszkópban. A migrációs areákat mm2-ben adtuk meg. Leukocita migráció Egészséges donorok polymorphonukleáris sejtjei- j5 nek direkt (random) migrációját a 11., 12. és 14. példa terméke fokozta, a dózis-optimum 1,0 ug/ml koncentrációnak adódott, a nagyobb dózis (10,0 <ug/ml) hatás kevésbé volt kifejezett (III táblázat). III. Táblázat 20 A 11. példa termékének in vitro hatása emberi polymorphonukleáris leukoeyták direkt (random) migrációjára. Migrációs area (mm2). Hét egészséges kontroll átlagértékei: ±S, E. M. Kontroll 0.1 Dózis (ug/ml) 1.0 100 10.02 ±1,65 10,51 ± 1,22* 12,25 ± 1,58^ 11,24 ± 1,693 1 nem szignifikáns 30 ^ szignifikáns (p < 0,01) ^ szignifikáns (p*'' 0,05) Mitogén-indukált blasztos transzformáció A limfocitákat 10% dekomplementált borjúszérummal, antibiotikumokkal és 25 mH HEPES-sel (Serva) komplettált TC 199 tápfolyadékban tenyésztettük. 200 ;ul 2xl05 limfocitát tartalmazó sejtszuszpenziót Sterilin (Anglia) gyártmányú mikroplate-re mértünk 5-5 párhuzamossal. Phytohaemagglutinint (Leucoagglutinin, Pharmacia Svédország) 2 ill. 10 ug/ml concanavalin A-t (Carbiochem) 25 ug/ml végkoncentrációban adtuk a tenyésztéshez. A kultúrákat 72 órán át 5% CC^.t tartalmazó atmoszférában 37°C-on tenyésztettük. A tenyésztési idő befejezése előtt 8 órával 0,5 pCi 3 H-thymidint (Chemapol, Cseszlovákia) adtunk a mintákhoz. Az inkorporációt a tenyészetek fagyasztásával állítottuk le. Felolvasztás után a mintákat automata harvesterrel (Dynatech) szűrtük. A minták radioaktivitását szcintillációs számlálóban mértük, az aktivitást c. p. m.-ben adtuk meg. (IV. V. Táblázat). Statisztikai analízis Szignifikanciát egymintás 2T2 teszttel határoztuk meg. Az eredményeket all. példa termékére az I— II- III táblázat mutatja. IV. táblázat All. példa termékének in vitro hatása emberi lymphociták PHA val és Con A-val stimulált blasztos transzformációjára. Normális reaktivitásé egészséges kontrollok, n. :6. Átlag c. p. m. + S.E.M. Mítogén Kontroll 0,1 Dózis (ug/ml) 1,0 10,0 PH A 2 ug/ml PHA 10ug/ml Con A 25(Ug/ml 21166 ± 3774 29959 ± 4051 10545 ± 3414 22233 ± 3688 29969 ± 3557 10564 ± 3764 23156 ± 2737 33826 ± 3638 14089 ± 2602 25404 33790 17038 ± 2860 ± 5203 ± 3202 V. táblázat A 12. példa termékének in vitro hatása emberi iymphocyták PHA-val és Con A-val stimulált blasztos transzormációjára, Csökkent reaktivitású (tumoros és SLE-s) betegek, n :6, átlag c. p. m. ±S. E. M. Kezelés/mitogén Kontroll 0,1 Dózis (ug/ml) 1,0 10,0 HA 2ug/ml PHA lOug/ml Con A 25/Ug/ml 3034 ± 1293 5267 ± 1392 804 ± 307 2877 ± 984 5802 ± 1504 1097 ± 354 4344 ± 1153 6323 ± 1161 935 ± 363 4716 ± 6968 ± 1023 ± 1287 1669 361 4
