196715. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombolitikus hatású gyógyászati készítmények előállítására
1 2 196.715 A találmányt közelebbről — a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi kísérletekkel kívánjuk ismertetni. 1. kísérlet Különféle plazminogén aktivátorok és azok kombinációinak hatását vizsgáljuk nyulakban kísérletesen előidézett trombusra. , 2,4-3,0 kg-os altatott fehér nyulak (Uj-Zélandi fajta) külső nyaki vénáját közel 4 cm-es hosszúságban felvágjuk. A véna egy szegmensét ércsíptető alkalmazásával izoláljuk és meghatározzuk térfogatát. A kiürített szegmensbe 0,1 ml trombin-oldatot (100 NIH-egység/ml) viszünk, majd 10-20 jul, radioaktív jóddal jelzett humán fibrinogénnel kevert friss vért adunk hozzá. A vér mennyisége a véredény-szegmens előzetesen meghatározott térfogatának felel meg. A véredényben kialakult vérrögöt 30 percen át hagyjuk öregedni, majd eltávolítjuk az ércsiptetőket. Ezután meghatározzuk a radioaktivitás mennyiségét a véredény-szegmensben. Ezután a nyulaknak a marginális fül-vénán át infúzió formájában különféle trombolitikus aktivitású anyagokat, mégpedig t-PA-t, urokinázt, scp-PA-t és ezek kombinációját adagoljuk. Ebből a célból a trombolitikus szerek meghatározott mennyiségeit fiziológiás sóoldattal 20 ml végtérfogatra hígítjuk. Az infúziót 4 órán át adagoljuk. Ezután 30 perccel a trombust tartalmazó véredény-szegmenst mindkét végén bevarrjuk és eltávolítjuk, majd meghatározzuk a maradék radioaktivitást. A trombolitikus hatás fokát, mint az eredeti és a maradék radioaktivitás közötti százalékos különböséget a véredény-szegmensben, kiszámítjuk. Izotóp-mérleget készítünk oly módon, hogy összeadjuk az eltávolított véredény-szegmensben és a keringő vérben mért radioaktivitást a kísérlet végén, és a kapott értéket a véredény-szegmensben lévő eredeti radioaktivitás százalékában fejezzük ki. A pajzsmirigyben és a tüdőkben a radioaktivitás elhanyagolható. A trombolitikus hatású szerek infúziója közben, és a fenti időszak előtt és után is számos vérmintát veszünk a radioaktivitás, fibrínogén-tartalom, dj-antiplazmin-tártalom és a t-PA- és scu-PA-tartalom meghatározására. 5 A kísérleti modell részletesebb ismertetése a (D. Collen és munkatársai: J. Clin, Invest. 73, 368-376 /1983/) irodalmi helyen található. A kísérletekben használt t-PA-t melanoma sejtvonal kondicionált sejttenyészetéből nyertük, D.C. Rijken és munkatársai in (J. Bioi. Giern. 256, 7035-7041 /I98l/) és D. Collen és munkatársai (Thromb. Haemost. 48, 294-296 /1982/) módszere szerint. Az urokináz kereskedelmi forgalomban lévő termék volt, és az scu-PA-t tüdő-adenokarcinoma sejtvonal kondicionált tenyészetéből nyertük, D.C, Stump és munkatársai (Throm. lg Haemost. 54, 122 /1985/) módszere szerint. A kísérleti eredményeket az 1. táblázatban ismertetjük, az ott megadott értékek három vizsgálat átlagát jelentik. A kontroli-csoportban — amely csak oldószert kapott — a trombolitikus átlagos értéke 9 ± 1%. 20 Az 1. táblázat adataiból látható, hogy a t-PA, urokináz vagy scu-PA szisztémás infúziójával trombolitikus hatást érünk el, amelynek mértéke dózis-függő. Az is tátható továbbá, hogy az urokináz trombolitikus dózisban adagolva nagymértékben fibrinogén-lebomlást okoz. 25 A t-PA és scu-PA egyidejű alkalmazása sokkal kisebb dózisokban összehasonlítható mértékű trombolizist okoz. A t-PA és urokináz egyidejű alkalmazása szintén szinergizált trombolitikus hatást az urokináz és seu-PA egyidejű alkalmazása esetén. A kombinált infúziók egyike sem okoz szisztémás fibrinogén-le'^'-l bomlást. A fenti eredmények szerint tiszta szinergizált hatás van a t-PA és scu-PA, valamint a t-PA és urokináz között az in vivo trombolitikus hatást tekintve. A fenti hatóanyagok kombinációi a külön-külön szükséges trombolitikus dózisok 10-20%-ának megfelelő dózisokban is azonos mértékű, vagy még nagyobb trombolitikus hatást fejtenek ki. A szinergizmus 1:10 és 10:1 közötti t-PAm-PA tömegarányoknál észlelhető, és még kifejezettebb szinergizmus van 1:2 és 2:1 tömegarányok között. 1. táblázat : t-PA Dózis (mg/kg) scu-PA Urokináz Trombollzis Izotóp visszanyerés (%) (%) Fibrinogénszint (%) 0 0 0 9± 1 99 ±3 92 ± 11 0,05 0 0 14 ± 1 97 ±2 113 ± 5 0,125 0 0 24 ± 1 89 ± 1 105 ± 1 0,25 0 0 32 ± í 89 ± 2 93+ 1 0,50 0 0 57 ±6 83 ± 1 101 ± 3 0 0,20 0 13 ± 1 94 ± 1 92 ± 12 0 0,50 0 21 ± 1 94 ±3 97 ± 3 0 1,0 0 31 ± l 90 ± 1 92 ± 2 0 0 0,2 12 ± 1 99 ± 2 101 ± 5 0 0 0,5 15 ±2 94 ±2 95 ±5 0 0 1,0 23 ± 1 95 ± 1 91 ± 7 0 0 2,0 44 ±3 98 ±5 37 ± 26 3
