196627. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 9 alfa-hidroxi-4-androsztén-3,17-dion mikrobiológiai előállítására
7 196 627 8 náthátok. A törzs fémion igényét a természetes eredetű táptalajok kielégítik. A törzs növekedését az átalakítandó szteroidok jelenléte nem zavarja, ezért a szubsztrátot a táptalajban sterilezhetjük még beoltás előtt. Az egyenletes, gyors növekedés szempontjából előnyös a polioxictilén-szorbitán-monoolcat (Twccn 80) jelenléte a táptalajban. A tenyésztés és a biokonverzió 28 °C és 37 °C között végezhető, előnyösen 32 °C-on. A reakció előrehaladását vékonyrétegkromatográfiás módszerrel követhetjük. Az átalakítás időtartama rövid, 100-120 óra. Kísérleti tapasztalataink szerint a Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 törzs a 9a-hidroxi4-androsztén-3,17-diont főtermékként, jó hozammal állítja elő természetes szterinekből. A fermentlébcn a törzs kis mennyiségben részlegesen lebontott oldalláncú átalakítási termékeket: 9a-hidroxi-3-oxo-23,24-dinor-4-kolén-22-sav metilésztert, 9a-hidroxi-3-oxo-23,24-dinor-4-kőién-22-savat, 9or-hidroxi-3-oxo-23,24-dinor-4,l 7-(20)-koladién-22-savat és 9a-hidroxi-3-oxo-23,24-dinor4,17(20)-koladién-22-aldehidet is felhalmoz. A szterinek mikrobiológiai lebontásával keletkező termékek fermentlébő! való kinyerésére előnyösen alkalmazhatunk extrakciós módszereket. Célszerű a mikroorganizmus sejtjeit szűréssel vagy centrifugálással a tápközegből elkülöníteni. A mikroorganizmus sejtekről alkoholokkal, például metanollal oldhatók le a mikrobiológiai átalakítás során keletkező termékek, míg a tápközegben oldott termékek pH = 2-re történő savanyítás után vízzel nem elegyedő oldószerrel, például klórozott szénhidrogénekkel vagy etil-acetáttal extrahálhatók. A 9a-hidroxi4-androsztén-3,17-,dion főterméket az egyéb, kis mennyiségben képződő lebontási termékektől oszlop- és preparatív vékonyrétegkromatográfiás módszerekkel, valamint átkristályosítással választhatjuk el. Az izolált lebontási termékek szerkezetét UV, ÍR, PMR és tömegspektroszkópiás vizsgálatokkal azonosítottuk. A találmány szerinti eljárást az alábbi példával szemléltetjük: 1. példa Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 (MNG 00339) jelű törzs burgonyás-glükózos ferdeagaron növesztett 4-5 napos tenyészetéről ip ml steril vízzel sejtszuszpenziót készítünk és ennek 5 mi ével oltunk 3 literes Erlenmeyer lombikban sterilezett 800 ml UFR jelű inokulum táptalajt, melynek összetétele a következő: UFR táptalaj: glicerin 8 g karbainid 0,4 g szójaliszt l,6g élesztőkivonat 0,8 g ammónium-klorid 2,4 g kalcium-karbonát 2,4 g kálium-dihidrogén-foszfát 0,4 g magnézium-szulfát-víz (1:7) 0,4 g vas(HI)-klorid-víz (1:6) 0,4 g Tween-80 0,4 g 800 ml csapvízben. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,0 értékre állítjuk és a sterilezést 121 °C-on 45 percig végezzük. A lombikot 32 °Con. malomszila rázógépen (340 fordulat/pcrc. 3,5 cm kitérés) 3 napig rázatjuk, majd a kapott inokulum rázott tenyészettel 10 1-es laboratóriumi fermentorban 60 percig 121 °C-on sterilezett 5 liter UHF jelű táptalajt oltunk be. UHFjeiű táptalaj összetétele: glicerin 50 g ammónium-klorid *5 g kalcium-karbonát 15 g szójaliszt 10g kálium-dihidrogén-foszfát 2,5 g karbainid 2,5 g 2: I arányú /J-sziloszterinkampeszterin keverék 100 g polipropilén-glikol 30 g Tween-80 10g csapvízzel 5 literre feltöltve. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,0 értékre állítjuk. A beoltott tenyészetet 32 °C-on vízfürdőbe helyezve termosztáljuk, és 350/pcrc fordulatszámmal kevertetjük. A tenyészetet kezdetben 90 liter/óra, majd a habzás csökkenő mértékének megfelelően 150 liter/óra levegővel áramoltatjuk át. A fermentációt 120 óráig folytatjuk, majd a fermcntléből kinyerjük a 0-sziloszlcrin-kampcszterin (2:1) arányú keverékből képződő lebontási termékeket. 1 liter fermentléből, mely a fermentáció kezdetén 20 g nyers szitoszterint (|3-szitoszterin-kampeszterin 2:1 arányú keveréke) tartalmazott, az alábbi módon izoláljuk a szterinátalakítási termékeket. A fermentléből szűréssel elkülönítjük a sejteket, melyekről háromszor 200 ml metanollal leoldjuk a szterin-lebontási termékeket, és az át nem alakult kiindulási anyagot. Az egyesített metanolos eluátumot vákuumban bepároljuk, és így 12 g maradékot kapunk. A fermentlé szürlctét 2n kénsavval megsavanyítjuk (pH = 2), majd a kivált csapadékot, mely 9a-hidroxi-3-oxo-23,24-dinor4-kolén-22-sav és 9a-hidroxi-3- oxo-23,24-dinor4,l 7(20)-koladién-22-sav keverékét tartalmazza, leszűrjük és foszfor-pentoxid felett vákuumban szárítjuk 4 órán keresztül. így 1 g savkeverékhez jutunk. A savkeverék leszűrésekor kapott s/.ürlclct kétszer 200 ml ctii-acetátlal extraháljuk. Az egyesített ctilacetátos extraktumot vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és vákuumban bepároljuk, így 3,1 g maradékot kapunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
