196625. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis-b vírus vakcina előállítására

15

196 625

16

I. tablózat

S. cercvisiae lcl697d (pRJT10673) és lc!697d (pRITl06 74) törzsek sejtmentes kivonataival immunizált nyitlak HBsAg-antitest termelése

A kivonat forrása

A nyűi sor* száma

0.

anti-HBsAg szérum- 23.

titer az Ausab® mérés alapján a 44. 51. napon

65.

lcl697d

i

negatív

negatív

1/16

1/16

1/64

(pRIT10673)

2

negatív

1/1024

1/8192

1/8192

1/4096-törzs

3

negatív

1/64

1/16

1/16

1/8192

1/16

4

negatív

1/64

1 /2048

1/1024

1/2048

5

negatív

1/1024

1/256

1/1024

1 /2048

6

negatív

1/16

1/25 <>

1/1024

1 /2048

lcl697d

7

negatív

negatív

—

negatív

—

(pRIT10674)

8

negatív

1/1-negatív

negatív

törzs

9

negatív

negatívnegatív

negatív

a A szérumnak az a legnagyobb hígítása, amely az Ausab® mérés során pozitív eredményt ad.

9. példa

Az arg regulátor szakaszt tartalmazó pRITl 0749 plazmid előállítása pMC200-ból

Tisztított pMC200-at HincII-vel emésztünk, és 10 %-os akrilamid-gélen elektroforézisnek vetjük alá. A gélről elektro-eluálás és etanolos kicsapás segítségével elkülönítjük az arg 3 szabályzó szakaszt tartalmazó, 1940 bp értékű fragmentumot. E fragmentumból körülbelül 4 ug-ot 0,2 egység Bal31 exonukleázzal 1-3 másodpercig 30 °C hőmérsékleten 100 pl

8,0 pH értékű, 12,5 mmól magnézium-kloridot, 12, 5 mmól kalcium-kloridot, 200 mmól nátrium-kloridot, 1 mmól EDTA-t és 200 mmól trometamin hidrokloridot tartalmazó pufferoldatban iukubálunk. Az így kezelt DNS-t fenollal extraháljuk, és clanollal kicsapjuk. Egy 1 pg mennyiségű alikvot részt T4 DNS-polimerázzal dezoxi-nukleotid-trifoszfátok jelenlétében inkubálunk az egyszálú végződések helyreállítása céljából, majd EcoRl endonukleázzal emésztjük. Ezzel az eljárással olyan DNS-fragmentumok keletkeznek, amelyek hosszúsága a Bal 31-val való hasítás következtében változó. Az összes fragmentumnak rögzített EcoRl terjedelme van az egyik végén, a másik végén tompa végződéssel, némi távolsággal elhelyezkedve az eredeti HincII-helytől és az OCT- fehérjét iniciáló kodontól. Az aig 3 regulátor szakaszát tartalmazó, körülbelül 1480 bp értékű fragmentumokat 7,5 %-os akrilamid-gélen végzett clcktroforézissel elkülönítjük, majd elektro-eluálást és etanolos kicsapást végzünk. Ez a lehasított szabályzó szakasz azért előnyös, mert képes elősegíteni azt a transzkripciót, amely az. OCT-aminosav-szckvcnciáktól mentes fehérje szintéziséhez vezet, amint ezt az alábbi

10. példába leírjuk.

Egy második reakciósorozatban pMC200-at Xbalval emésztünk, és az 5' egyszálú végződéseket betölt-25

jük, vagy tompa végűbe T4 DNS-polimerázzal dezoxinukleotid-trifoszfátok jelenlétében végzett inkubálással. Ezt a DNS-t EcoRl-val emésztjük, és egy nagy terjedelmű EcoRI-T4/XhaÍ fragmentumot, melynek körülbelül 5700 bp értéke van, és a 3'től az Xbal helyig elhelyezkedő élesztőgomba-DNS-szekvenciákat a pBR322 szekvenciákkal együtt tartalmazza, elektroforézissel, majd ezt követő elektro-eluálással és etanolos kicsapással tisztítjuk. E fragmentumot elegyítjük és összekötjük az 1480 bp értékű, promotert tartalmazó fragmentumokkal.

A ligálási reakcióhoz használt elegyet alkalmazzuk E. coli KI 2 MM294 törzs kompetens sejtjeinek 40 transzformálására. A transzformánsokat ampicillint tartalmazó agaron szelektáljuk. A plazmid-DNS-t a transzformans kolóniákból Bimbóim és munkatársai eljárásával [Nucl. Acid. Res., 7, 1513 (1979)jelkülönítjük, és Xbal-va! végzett emésztéssel vizsgáljuk egy 45 Xbal-hely jelenlétét. Xbal-hely csak azokban a plazmidokban van jelen, amelyekben egy második reakciósorból származó fragmentumon a betöltött Xbal helyet egy másik, az első rcakciósorból származó olyan fragmentummal kötöttük le, amely 3'-T 50 maradékkal végződik, s így egy Xbal-t felismerő TCTAGA szekvencia egy új elhelyezkedésben helyreállt, Egy Xbal-hellye! rendelkező plazmidot pRlT- 10749 plazmidként azonosítottunk. A 6. ábrán látható e manipulációkat bemutató folyamat. Az E. coli 55 KI2 MM294 (pRITI0749) törzs az EPC és a Budapesti Egyezmény szabályai szerint az. American Type Culture Collection-ban (Rockville, Maryland, Egyesült Államok) 1982. június 2-án ATCC 39133 jegyzékszámmal nyert elhelyezést.

60 Egy pRIT10749 mintát BslEII és Xbal kombinációjával emésztünk, A deléciót szenvedő arg 3 regulátor szakasz mérete körülbelül 210 bp-rc tehető olyan pMC200-val összehasonlítva, amelyet BstEII-vel és Xbal-val ugyanígy emésztettünk, és összehasonlítva

9