196625. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis-b vírus vakcina előállítására
17 196 625 18 a Fuchs és munkatársai által [Gene, 4, 1 (1978)] leírt 0 xl74 DNS fág fragmentumainak molekulasúlyával. A pRITI0749 BstEII-Xbal'fragmcntum DNS-szekvenciájának meghatározása céljából a plazmid-DNS-t BstEII-val emésztjük, y32 P-ATP-val jelezzük, és BamHI-endonukleázzal emésztjük a 2000 bp értékű fragmentum felszabadítására, amelyet clektroeluálással és ctanolos kicsapással tisztítunk. A jelzett fragmentum DNS-szekvcnciájának megállapítását Maxam és munkatársai [Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)] kémiai modifikációs módszerével végezzük. E szekvencia egyik része a meghatározás szerint CCCATCAACTTGTACACTCGTC7MGA A jelölt nuklcotidok az 5700 bp értékű EcoRI-T4/Xbal-fragmentumból származnak. A 4. ábrán bemutatott DNS- szckvcncia megfelelő szakaszának összehasonlítása azt mutatja, hogy a helyreállított Xbal-hely az 5' át nem fordított vezető szakaszban 9 nukleotiddal feljebb helyezkednek el a pMC200 élesztőgomba-DNS- inszertum eredeti HincII-helyén. 10. példa A HBsAg-t és regulator-szakaszokat tartalmazó pRIT10759 és pRIT10761 plazmidok előállítása pRIT10749 és pRIT10601 kombinálásával pRIT10601 plazmidot Hhal-endonukleázzal emésztünk, majd 7,5 %-os akrilamid-gélen elektroforézisnek vetjük alá. Elektro-eluálás és etanolos kicsapás segítségével egy 1100 bp értékű fragmentumot különítünk el. E fragmentum egy részének DNS-szckvenciája tartalmazza az ayw szerotípusú IIBsAg ismert N-terminális aminosav-szekvenciájának megfelelő szekvenciát [Peterson és munkatársai: Viral Hepatitis, kiadók: G. N. Vyas, S., N. Cohen és R. Schmid, Franklin Institute Press, Philadelphia, 1978, 569. old.]. A fragmentum 6 nukleotidot tartalmaz, amelyek a HBsAg-t iniciáló kodonhoz képest 5'-ben helyezkednek el, továbbá tartalmazza a teljes HBsAg-t kódoló szekvenciát és körülbelül 390 3'- (ál nem fordított) -nukleotidot. pRIT10749 plazmid-DNS-t Xbal-gyel emésztünk, és ebből a DNS-ből 400 ng-ot körülbelül 280 ng tisztított Hhal-fragmcntumma! elegyítünk. Az elegye) 0,5 egység T4 ONS-polimcrá/.zal 20jul 7,5 pH értékű, 20 mmól trometamin hidrokloridot, 10 mmól magnézium-kloridot, 1 mmól ditio-treitet, 33 mmól dATP-t, 33 mmól dCTP-t, 33 mmól dTTP-t és 33 mmól dGTP-t tartalmazó, 7,5 pH értékű pufferoldatban 30 percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. E reakcióelegyhez 2,5 pl 1 mmólos ATP-t, 2,5 pl 10 mmólos EDTA-t és 2 pl (2 egység) T4-DNS-ligázt adunk, és az elegyet 16 órán át 15 °C hőmérsékleten in kub áljuk. A kötési reakció elvégzése után az elegyet felhasználjuk E. coli KI 2 MM294 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására, az ampicillinncl szemben rezisztens transzformánsok szelektálásával. Számos ilyen transzformánsból készítettünk plazmidot, és ezt restrikciós endonukleázzal emésztve gél-elektroforézissel elemeztük. Az eredmények azt mutatják, hogy a tompa végződésű HBV-fragmcnlum az Xbal-val emésztett pRIT 10749 plazmidba mindkét lehetséges orientációban inszertálódik. Egy ilyen pRIT10761 plazmid 1100 bp értékű inszertumot tartalmaz megfelelő orientációban az arg 3 promoter-ből származó HBsAgszekvencia transzkripciójára, és egy 271 bp értékű fragmentumot ad BstEII-vcl és Xbal-val végzett, egymást követő emésztés útján. Ezt a 7. ábra mutatja. Egy második, pRl'1’10759 plazmid az inszertumot meg nem felelő orientációban tartalmazza, és BstEII és Xbal endonukleázokkal végzett kombinált emésztés során egy 1175 bp becsült értékű fragmentumot ad. A pRITI076! esetében az arg 3 regulátor szakasz IIBsAg inszertum bcépülési helyén meghatároztuk a nukleoiid-szckvcneiát a BslEll-Xbal 271 bp értékű fragmentum szekvenciájának meghatározása útján Maxam és munkatársai |Mcthods in Enzymology, 65, 499 (1980)] kémiai modifikációs eljárásával, az Xbal végződés 732P-ATP-vel végzett kicserélődéses jelzésével. Az arg 3 regulátor szakaszának meghatározott szekvenciája a IIBsAg heépiilési helyén TACACTCGTCTACTGAAC/I TG. Látható, hogy az Xbal restrikciós helyet a T4 DNS-poIimeráz nem állította helyre tökéletesen, és egy guanincsoport veszendőbe ment. Az arg 3 át nem fordított vezető szakaszát közvetlenül követi 6 nukleotid (CTGAAC), amely IIBV-eredetű, és ezt követi a HBsAg-t iniciáló kodon (ATG) és a IIBsAg szerkezeti gént kódoló szekvencia. A IIBsAg-t iniciáló kodon az első iniciáló kodon, amely az arg 3 protomertől lefelé helyezkedik el. Ennek következtében a DNS-ről átírt mRNS transzlációja ennél a kodonnál iniciál, és az így szintetizált IIBsAg mentes lesz. az idegen aminosavesoportoktól. Az így színleli/.áll IIBsAg nem fiíziós fehérje; szerkezetileg lényegében azonos az autentikus HBsAgval. 11. példa pRITI0764 és pRIT10765 plazmid előállítása pRIT10761 plazmidnak YEpl 3AIIindIII-val való kombinálása útján pRIT10761 és pRIT10759 plazmidot külön-külön Pstl-va! és BamlII-val emésztünk a pBR322 replikon egység lebontása céljából, majd HindlII-val folytatjuk az emésztést az inszertált IIBV DNS-t és a regulátor szakaszt hordozó DNS-fragmentum felszabadítása végett. A DNS-eket fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és 0,01 mól trometamin hidrokloridot és 0,001 mól EDTA-t tartalmazó, 7,5 pH értékű pufferoldatban feloldjuk. Minden egyes DNS-készítmény 0,6 pg súlyú részletét külön-külön elegyítjük a fentiek szerint előállított, IlindlII-val emésztett, alkálikus foszfatázzal kezelt YEpl3AHindIII DNS 0,3 pg mennyiségével, és az elegyet ligálási reakcióba visszük. A ligálási reakció után kapott elegyet alkalmazzuk E. coli KI 2 MM294 kompetens sejtjeinek transzformálására, az. ampieillin-rczisztens transzformánsok szelektálásával. Az egyik transzformáns olyan pRIT10764 plazmidot tartalmaz, amely az YEpl 3 HindlII-ba inszertált pRITl 0761-bői származó 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
