196625. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis-b vírus vakcina előállítására
oldatban, (3-glukuronida'z (0,24 egység/ml vdgkoncentrációban) és aril-szulfatáz (1,2 egyésg/m) végkoncentrációban) keverékének alkalmazásával végezzük. Az élesztőgomba-protoplasztokat elkülönítetten 10 pg pRITl 0673- és 10 jug pRITÍ 0674-val inkubáljuk, és a transzformánsokat leuejnbiányos agar-agaron regenerálva elkülönítjük. A regeneráló agar-agaron tenyésztett kolóniákat kinyerjük, és aminosavaknt nem tartalmazó, 2 % glukózt, 2 % agar-agart és 80 pg/ml hisztidint tartalmazó 0,675 %-os élesztő-nitrogén alapközegre rétegezzük, majd 30 °C hőmérsékleten tenyésztjük. Egy DC5 törzs kolóniát pRIT- 10673-mnl transzformáltunk, ezt S. ccrcvisiac törzs DC5 (pRIT10673) elnevezéssel jelöljük. Egy másik kolóniát pRITl 0674-val transzformáltunk, ezt S. cerevisiae törzs DC5 (pRIT10674) elnevezéssel jelöljük. DC5 (pRITJ0673) és DC5 (pRITl0674) törzsek tenyészeteit 80 pg/ml hisztidint tartalmazó élesztőnitrogén alapközegen 620 pin hullámhosszúságon 0,33—1,0 optikai sűrűségig tenyésztünk. Ez utóbbi törzs negatív kontrollként használható, mivel a HBsAg-t kódoló szekvenciát a regulator szakasznak meg nem felelő orientációban kötve tartalmazza. A sejteket ccnlrirugálással elkülönítjük, foszfáttal puliérólt konyhasóoidaltal mossuk, és 5 ml I mtnóíos feníí-metíl-szuffonil-fluoriddal kiegészített — foszfáttal pufferolt konyhasóoldatban 20— 160-szoros koncentrációig reszuszpenzáljuk. A sejteket 83 mega-Pa nyomáson French Pressure Cell berendezésen átvezetve feltörjük, majd a lizátumot 770 x g sebességgel 15 percig, s utána 30 000 x g sebességgel 30 percig centrifugáljuk. A felülúszókat elkülönítjük, és Millex GV menrbránszú'rőn megszűrjük. A felülúszókat Ausria® radioimmun-eljárással megvizsgáljuk, tartalmaznak-e specifikus anti-HBsAg antitestekkel reagáló fehérjét. Az ilyen módon előállított, derített S. ecrivísiac DC5 (pRITl 0673) törzs derített sejtkivonatai ebben a radioimmun-mérésben még akkor is pozitív reakciót adnak, ha foszfáttal pufferolt konyhasóoldatban 16-256-szoros hígítást kell alkalmaznunk. Ezzel ellentétben a DC5 (pRIT10674) törzs kivonatai e mérés során az anti-HBsAg antitestekkel reagáló fehérjék jelenlétére vonatkozóan negatív reakciót adnak. B) S. cerevisiae lcl697d törzs Az S. cerevisiae 1 cl697cl törzs az EPC és a Budapesti Egyezmény szabályai szerint az American Type Culture Collection-bail 1982. június 2-án ATCC 20631 jegyzékszámmal nyert elhelyezést. A fentebb leírt eljárás alkalmazásával az lcl697d arginin-braditróf törzset (arg] ±, leu 2-1) pRITl0673 és pRIT10674 alkalmazásával transzformáljuk. A braöitróf törzs egyik leucin-függctlen kolóniáját pRITl0673 alkalmazásával transzformáltuk, és S. ccrevisiae lel 697d (pRIT10673) törzs elnevezéssel jelöljük. Egy másik leucin-független kolóniát, amelyet 13 pRTIT0674 alkalmazásával transzformáltunk, S. cerevisiae lel697d (pRITl0674) elnevezéssel jelölünk. Az lcl697d (pRIT10673) és lcl697d (pRIT- 10674) törzsek tenyészeteit 20 pg/ml argininncl kiegészített élcsztő-nitrogcn alapközegen tenyésztjük. A sejteket elkülönítjük, cs a fentebb leírt módon sejtkivonatokat készítünk. Az 1 cl697d (pRITl0673) törzsből származó, derített sejtkivonatok az Ausria® radioirnmun-niérés során pozitív eredményeket adnak, még akkor is, ha 1/2048 hígítást alkalmazunk; ezzel szemben az 1 cl 697d (pRITl 0674) törzsből származó kivonatok c mérés során egyértelműen negatív eredményt adnak. Ezekből az eredményekből következik, hogy a pRlT10673-val transzformált DC5 és lcl697d törzshöz tartozó élesztősejtek specifikusan szintetizálják a UBsAg-l egy MBsAg-dcterminánsokat tartalmazó, fúziós fehérje alakjában. 14 8. példa Nyíllak immunizálása S. cerevisiae Icl6ö7d (pRITl0673) törzsből származó HBsAg-val S. cerevisiae lcl687d (pRITl0673)törzset 620pm hullámhosszúságon megfigyelhető 0,60 optikai sűrűségig tenyésztünk, és centrifugálással összegyűjtjük. A sejteket 40-szeres koncentrációval 1 mmól fenilmetii-szulfonil-fluoridot tartalmazó, foszfáttal pufferolt konyliasóoldatban reszuszpendáljuk. A derített sejtkivonatot a 7. példa szerint állítjuk elő. Ugyanúgy készítjük az lcl697d (pRITl0674) törzs derített sejtkivonatát. Ezeket az extraktumokat nyulak immunizálására alkalmazzuk. Egy 6 nyűiből álló első csoportnak pareníerális befecskendezéssel 1 ml 1cl697d (pRITl 0673) törzsből származó kivonatot adagolunk, 1 ml Freund-féle teljes adjuvánssal együtt a 0., 9., 15., 30. és 37. napokon. Egy 3 nyúlból álló, második csoportnak parenterális befecskendezéssel 1 ml lcl697d (pRITl0674) törzsből származó kivonatot adagolunk, 1 ml Freuml-féle teljes adjuvánssal együtt ugyanazokon a napokon. Mindkét állatcsoportból vérszérumot veszünk a 0. (immunizálás előtti), 23., 51. és 65. napokon, az első csoporttól a 44. napon is, és az Ausab® radioimmun-mérés alkalmazásával az anti-HBsAg antitestek jelenlétére vonatkozó vizsgálatot végzünk. Amint az 1. táblázat adatai mutatják, 4 nyúl azon 6 közül, akik lcl697d (pRIT10673) törzsből származó kivonatot kaptak, anti-HBsAg antitesteket termeltek. Ezzel szemben azon 3 kontrollnyúl közül, amelyek lcl697d (pRIT10674) törzsből származó kivonatot kaptak, egy sem termelt anti- HBsAg antitesteket. Ezekből az eredményekből az következik, hogy az lcl697d (pRITl 0673) törzs kivonatai MBsAg-t tartalmaznak, amely felhasználható olyan vakcinában, amely emberekben a HBV-fertőzés elleni védelmet komolyabb mellékhatások nélkül serkenti. 196 625 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
