196625. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis-b vírus vakcina előállítására
11 196 625 12 tása végett. A 1350 bp értékű fragmentumot preparatív agaróz-gélen végzett elektroforézis és elektroeluálás segítségével tisztítjuk. Az eluált DNS-t ejkülönítjük, és etanolos kicsapással koncentráljuk, majd 20 júl 0,01 mólos 7,0 pH-értékű tometamin pufferoldatban feloldjuk. A BamHI-fragmentumnak — amely.a HBsAg-t kódoló szekvenciát larlalmazza — 0,3 jug mennyiségű alikvot részét 0,5 pg Bglll-val emésztett pMC200-val elegyítjük, és az elegyet T4 DNS-ligázzal inkubálva ligálási reakcióba visszük. A ligáit DNS-t felhasználjuk E. coji KI2 MM234 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására. A transzformánsokat 200 *rg/tnl arnpicillint tartalmazó agar-agar lemezeken elkülönítjük. 12 rezisztens kolóniát arnpicillint tartalmazó agar-agaron való sorozatos átoltással elkülönítünk, és a plazmidokat Bimbóim és munkatársai [Nucl. Acid. Res., 7 1513 (1979)] eljárásával elkülönítjük. Az agaróz-gélen elektroforézissel végzett elemzés azt mutatja, hogy a Hpal-val végzett restrikció valamennyi plazmidot hasította, s ez jelzi, hogy a Bamlll-fragmcntum inszcrtálódott, és a 12 transzformált kolóniában az inszertált fragmentum mindkét orientációja képviselve van. A plazmidokat céziuin-klorid + etidium-bromid sűrűség-gradienssel centrifugálva izoláljuk. Egy pRIT10671 plazmid tartalmazza a Bglll helyen beépült BamNI- fragmentumot olyan orientációban, amely megfelel a HBsAg-t kódoló szekvencia transzkripciójára, egy 286 aminosavat tartalmazó fúziós fehérje képzése céljából, amely az OCT 18 N-ferminális aminosavcsoportjából, a feltételezett HBsAg-prekurzor fehérje 42 aminosavcsoportjából és a HBsAg 226 aminosavcsoportjából áll. A fúziós fehérje HBsAg, amint ezt az alábbi 8. példában megmutatjuk. A pRIT10671-et tartalmazó transzformánsokat E. coli KI 2 törzs MM294 (pRIT10671) elnevezéssel jelöljük. A pRIT10671-et az 5. ábra mutatja. A pRIT 10640 intermedier plnzmidként való alkalmazása nem feltétlenül szükséges: a Bamlll-fragmeutum például a pRITl0616-ból is kihasítható. Egy másik plazmid, a pRIT10672 a BamHI-fragmentumot olyan orientációban tartalmazza, amely a HBsAg-t kódoló szekvencia átírására nem megfelelő. Ezen plazmidot tartalmazó transzformánsokat E. coli KI 2 törzs MM294 (pRIT10672) elnevezéssel jelöljük. 6. példa A pRITl0673 és pRITl0674 hordozó vektor-plazmidok előállítása pRITl0671 és pRITl0672 plazmidok YEpl 3 vektorral való kombinálása útján Az YEpl3 az E. coli és S. cerevisiae egyik „shuttle” („ingázó”) vektora, amelyet Broach és munkatársai írtak le [Gene, 8, 121 (1979)]. (Szállítója a J. Hicks, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Egyesült Államok.) Ilindlll-val történő emésztés útján a plazmidból egy kis méretű HindlII-fragmentumot hasítunk ki, és a plazmidot ismét lekötjük az YEpl3AHindIII plazmid-származék előállítása végett, amely egyetlen IíindlII-helyet tartalmaz. A tisztított YEpl3AHindlIl plazmidot HindlII-val emésztjük, és alkálikus foszfatázzal kezeljük az újrakötődés meggátlása végett. A DNS-t fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással kinyerjük. Tisztított pRIT 10671 és pRITl 067 2 plazmidot BamHl-val emésztünk, és alkálikus foszfatázzal kezelünk a pBR322 egység újraképződésének meggátlása céljából. Az így kezelt DNS-t llindlll-val tovább emésztjük egy 4650 bp értékű Hindlll-fragmentum felszabadítása céljából, amely a szabályzó szakasz és HBsAg gén fúzióját tartalmazza, majd a mintákat fenollal extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. 0,4 pg pRIT!0671-ből és 0,4 pg pRITl0672-ből származó DNS-készítményt külön-külön 0,4 pg HindlII-val emésztett YEpl3AHindIII-val elegyítünk, majd az így kapott clegycket T4 DNS-ligázzal inkubáljuk. Az így ligáit keverékek egy-egy részletét az E. coli KI 2 törzs MM294 kompetens sejtjeinek transzformálására alkalmazzuk. A transzformánsokat arnpicillint tartalmazó agar-agaron elkülönítjük. A tianszformáns kolóniákat izoláljuk, és plazmidlartalmukat Bimbóim és munkatársai [Nucl. Acid. Res., 7, 1513 (1979)] eljárásával vizsgáljuk. Az egyik transzformáns kolónia, az E. coli KI 2 MM294 (pRIT10673) törzs egy olyan pRITl 0673 plazmidot tartalmaz,amely a pRITl067Í* bői származó YEpl 3AllindIII-ba inszertált Ilin dilifragmentumot a megfelelő orientációban foglalja magában, amint ezt a 6. ábra mutatja. Egy másik transzformáns kolónia, az E. coli KI 2 törzs MM294 (pRITl 0674) egy olyan pRIT 10674 plazmidot tartalmaz, amely a pRITl 0672-ből származó YEpl3AHindUI-ba inszertált llindlll-fragmentumot a meg nem felelő orientációban tartalmazza. 7. példa Az élesztőgomba transzformálása pRITl0673 és pRITl0674 alkalmazásával A pRIT10673 és pRIT10674 plazmidokat E. coli KI 2 MM294 (pRITl 0673) és MM294 (pRITl0674) törzs derített lizátumaiból cézium-klorid + etidiumbromid sűrűség-gradiens-centrifugálással különítjük el. A) S. cerevisiae DC5 törzs Az S. cerevisiae DC5 törzset (leu 2-3, leu 2-112, his 3, can- 1-11) Broach és munkatársai [Gene, 8, 121 (1979)| írták le; a J. Nicks, Cold Spring Harbor Laboratories-ból (New York, Egyesült Államok) szereztük be, és az EPC és a Budapesti Egyezmény szabályai szerint az American Type Culture Collection-ban (Rockville, Maryland, Egyesült Államok) 1982. június 2-án ATTC 20630 jegyzékszámmal nyert elhelyezést. A DC5 törzs sejtjeit Hinnen cs munkatársai [Proc. Na ti. Acad. Sei. U. S., 75, 1929 (1978)] eljárásával tenyésztjük és előkészítjük a transzformálásra, azzal a kivétellel, hogy aprotoplaszt-készítést 0,8 mól szorbitot, 0,03 mól 2-merkapto-etanolt és 0,1 mól kálium-foszfátot tartalmazó, 7,5 pll-értékű puffer-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
