196625. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis-b vírus vakcina előállítására
9 196 625 10 A ligáit DNS-t tartalmazó elegyet felhasználjuk E. coli K12 C600 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására. A transzformánsokat 15 pg/ml tetraciklint tartalmazó agar-agaron elkülönítjük, és megvizsgáljuk klóramfenikollel szemben mutatott rezisztenciájuk elvesztését: ez jelzi, hogy a pACYC184 plazmid EcoRI helyére való inszertálás megtörtént. A transzformáit tenyészet egy pRITlOóló plazmidot tartalmaz, amely egy 3200 bp értékű beépült részt (inszertumot) tartalmazó pACYCl 84-ből áll, és magában foglalja a BBV DNS-t az EcoRI helyen. A 2. ábra mutatja a pRIT10616 restrikciós képét. Az EPC és a Budapest Treaty szabályai szerint egy E. coli KI 2 C600 törzs (pRIT10616) tenyészetet az American Type Culture Collection-ban (Rockville, Maryland, Egyesült Államok) 1982. június 2-án ATCC 39131 jegyzékszámmal elhelyeziünk. 3. példa A IIBsAg-l kódoló nukleolid-szckvcnciát tartalmazó pRIT10640 intermedier plazmid előállítása pRIT10616 és pBR313 kombinálásával A pRIT10616-ot (cézium-klorid + etidium-bromid) sűrűséggradiens-centrifugálással tisztítjuk, lényegében Kahn és munkatársai eljárásával [Methods in Enzymology,óS, 268(1979)]. A DNS-t BamHI endonukleázzal emésztjük, pBR313 plazmidból származó, BamHI-val emésztett, alkálikus foszfatázzal kezelt DNS-val elegyítjük, elvégezzük a kötési reakciót, és felhasználjuk az E. coli KI2 C600 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására lényegében az J. példában leírt eljárással. (A pBR313 plazmid beszerzési korlátozás nélkül az American Type Culture Collection-ban 37018 jegyzékszámmal nyert elhelyezést.) A transzformánsokat ampicillint tartalmazó agaragaron elkülönítjük, és tetraciklinnel szemben mutatott rezisztenciájuk elvesztését megvizsgáljuk: ez jelzi, hogy a pBR313 plazmid Bamlll helyére való inszertálás megtörtént. A transzformált tenyészet egy pRIT10640 plazmidot tartalmaz, amely a BanrHI helyen egy 1350 bp értékű pBR313 inszertumot tartalmaz. Az inszertum olyan nukleotid-szekvencia, amely HBsAg kódolására képes. Ez az inszeri unt egy feltételezett HBsAg prekurzor-fehérje egy részét kódolja, valamint a teljes felületi antigént és a 3'-nemkódoló szekvenciák közül az 565 bp értékűt foglalja magában. 4. példa Az arg 3 szabályzó szakaszt tartalmazó pMC200 intermedier plazmid előállítása az élesztőgombából származó arg 3 gén és pBR322 kombinálásával pYc(/ra3(7Zg3-nak Hindui val történő emésztése útján az arg 3 gént specifikáló 3300 bp értékű élesztőgomba-DNS fragmentumot állítjuk elő. A pYeura3arg3 plazmidot Crabeel és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sei. U. S., 78, 5026 (1981)] írták le. A 3300 bp értékű fragmentumot a pBR322 plazmid HindlII helyére klónozzuk, és E. coli KI2 MM294 törzsbe transzformáljuk, lényegében a fentebb leírtak szerint. A transzformánsokat ampicillint tartalmazó közegen elválasztjuk, és tetraciklinnel szemben mutatott rezisztenciájukat megvizsgáljuk. A transzformált kolónia olyan plazmidot, pMC200-at, tartalmaz, amelynek a llindlll helyén egy pBR322 inszertum épült be. Ez a plazmid tartalmazza az arg 3 szabályzó (regulátor) szakaszát, amely a HBsAg nukleotid-szekvenciáknak élesztősejtekben való transzkripcióját előidézni képes, amint ezt az előző példákban leírtuk. Az EPC és a Budapest Treaty (Budapesti Egyezmény) szabályai szerint egy E. coli KI2 MM294 (pMC200) törzs tenyészetet az American Type Culture Collection-ban 1982. június 2-án ATCC 39130 jegyzékszámmal elhelyeztünk. Az arg 3 gén azon részének nukleotid-szekvenciáját, amely magában foglalja az ornitin-karbamoil(ranszlcráz (OCT) N-lcrminális kódoló szekvenciáit és az 5'-(át nem fordított) irányító szakaszát — Huyghen és munkatársai meghatározták [Arch. Inti. Physical. Biochem., 89, B172 (1981)]. A 4. ábra az ismert szekvencia egyik 210 bp értékű fragmentumát mutatja. A 210 bp fragmentum a pMC200-ban levő 3300 bp értékű llindlll élesztőgomba HindlII DNS- inszertumon különleges Hindi, BglII és EcoRi helyeket tartalmaz; úgy vélik, hogy az OCT-fehérjét kódoló szekvencia kezdeményező (iniciáló) kodonja a befoglalt ATG kodon. Várható, hogy a HBsAg-t kódoló szekvenciáknak önmagában való vagy a klónozott HBV DNS-bőt származó IlBsAg-prekurzornnk és a HBsAg-mik az élesztőgomba-DNS Hindi, Bglll vagy EcoRi helyeire való bevezetése génfúziót és egy olyan hibridfehérje termelődését eredményezi, amely az arg 3 szabályzó szakaszának transzkripciójával (átírásával) és transzlációjával (átfordításával) jön létre, feltéve, hogy a génfúzió helyes orientációval megy végbe a fúzió helyén túl történő, folytatódó transzláció céljára. 5. példa A HBsAg-t és szabályzó szakaszokat tartalmazó pRI i 10671 és pRH'10672 intermedier plazmidok előállítása pRIT10640 és pMC200 kombinálásával 5 jug pMC200-at 6,4 egység BglII-val 37 °C hőmérsékleten 2,5 órán át emésztünk, utána azonos térfogatú 10,5 pH értékű olyan pufferoldattal hígítjuk, amely 0,1 mól glicint, 0,01 mól magnézium-kloridhexahidrátot és 0,1 tnmól cink-kloridot tartalmaz, s utána 0,5 egység borjúbélből származó alkálikus foszfatázzal az 5'-terminális foszfátcsoportok eltávolítása végett 30 percen át 37 °C-on inkubáljuk. Ezután az elegyet kétszer pufferral telített fenollal, majd utána háromszor éterrel cxtraháljuk. A DNS-t ctanollu! kicsapjuk, és 0,01 mólos 7,5 pH-értékfí trometamin pufferoldatban feloldjuk. 25 jug pRIT10640-t BamHI-val emésztünk, a HBV DNS 1350 bp értékű BamHI-fragmentumának kihasí5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
