196625. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis-b vírus vakcina előállítására
7 196 625 8 A) A Dane-részecskékben levő HBV-genom egyszálú szakaszait endogén DNS-poiimcráz.zal helyreállítjuk, úgy, hogy a Danc-részccskéket 8,0 pll-értékű, 50 mmól trometamin hidrokloridot, 10 mmól magnézium-kloridot, 500 mmól nátrium-kloridot, 0,5 mmól ditio-treitet, 50 mmól dATP-t, 50 mmól dCTP-t, 50 mmól dGTP-t és 8 mikromól 32 P-dTTP-t (fajlagos aktivitása 350 Ci/mmól) tartalmazó reakcióelegyben reszuszpendáljuk, és a reszuszpendált részecskéket 5 órán át 37 C hőmérsékleten inkubáljuk. A rcszuszpendált keveréket 7,0 píl-értékre hígítjuk 10 mmól trometamin hidrokloridot, 10 mmol EDTA-t, 100 mmól nátrium-kloridot és 0,02 % nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó pufferoldattal (pH 7,5), és 0,5 mg/tnl pronaz/al 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd fenollal extiakeiót és elanollal kicsapást végzünk. A DNS-nek BamHI restrikciós endonukleázzal való emésztése két radioaktív fragmentumot eredményez, amelyek mérete körülbelül 1450 bp, illetve 1600 bp az agaróz-gélen végzett elektroforézis és a gél autoradiográfiás vizsgálata alapján. B) Körülbelül 30 ng Dane-részecskékből származó DNS-t endogén DNS-polimerázzal nem jelzett dTTP jelenlétében helyreállítunk, Utána extraháljuk, és a fentiekben leírt módon kinyerjük. A DNS-t 100 ng pBR322 plazmiddal elegyítjük, amelyet előzőleg BamHI restrikciós endonukleázzal emésztettünk, és alkálikus foszfatázzal kezeltünk. (A pBR322 plazmidot általánosan alkalmazzuk a rekombináns DNS- eljárásokban; ez a plazmid beszerzési korlátozás nélkül az American Type Culture Collection-ban 37017 jegyzékszámmal nyert elhelyezést.) Azelegyet fenollal extraháljuk, etanollal kicsapást végzünk, majd centrifugáljuk, szárítjuk, és 12 jul olyan elegyben reszuszpendáljuk, amelynek pH értéke 5, s amely 50 mmól trometamin hidrokloridot, 1 mmól ATP-t, 10 mmól magnézium-kloridot, 10 mmól ditio-treitet, 50 jug/ml zselatint és 2 cgység/ml T4 DNS-ligá/.t tartalmaz. A szuszpenziót 4 órán át 10 °C-on inkubáljuk, majd 18 órán át jégben hűtjük. A ligáit DNS-t tartalmazó keveréket felhasználjuk E. coli KI2 C600 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására [ezen E. coli sejteket Cohen és munkatársai eljárásával állítjuk elő, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S., 69, 2110 (1972)]. A transzformánsokat 200 Mg/ml ampicillint tartalmazó, szilárd közegben választjuk el. Az elkülönített tenyészetek tetraciklinnel szemben mutatott rezisztenciájának elvesztését megvizsgáljuk: ez jelzi, hogy a pBR322 plazmid BatnHI helyén egy idegen DNS-fragmentum inszcrlálódolt. Úgy találtuk, hogy egy ilyen transzformans klón egy pRIT10601 plazmidot tartalmaz, amely BamHI-endonukleázzal végzett emésztés során egy 4360 bp értékű pBR322 fragmentumokat eredményez. [Az European Patent Convention (EPC, Európai Szabadalmi Egyezmény) és a Budapest Treaty (Budapesti Egyezmény) szabályai szerint egy E. coli K12 C600 (pRIT10601) törzs tenyészetet az American Type Culture Collection-ban (Amerikai Típustenyészeti Gyűjtemény, Rockville, Maryland, Egyesült Államok) 1982. június 2-án ATCC 39132 jegyzékszámmal elhelyeztünk.] Az. I. ábra mutatja a pRITlOöOl plazmid restrikciós endonukleázzal végzett hasításának képét (térképét). C) A Danc-részccskékből származó DNS és pRIT1060l különböző restrikciós enzimekkel végzett emésztése útján keletkezett fragmentumok méretét a következőképpen hasonlítjuk össze. A Danc-részecskékből származó DNS-t, azaz a IIBV DNS-t 32P-vel jelezzük a fentiekben leírt endogén polimeráz reakcióval vagy úgy, hogy a tisztított DNS-t E. coli-ból származó DNS-polimcráz 1 enzimmel kezeljük. A jelzett HBV l)NS-( pRITIOőOI plazmiddal elegyítjük, és az elegye! restrikciós endonukleázzal kezeljük, majd agaróz gélen elektroforézisnek vetjük alá. A gélt etidium-bromiddal festjük, és UV fényben fényképezzük a DNS- fragmentumok elhelyezkedésének megállapítása céljából, majd megszárítjuk, és auloradiográfiásau vizsgáljuk a radioaktív IIBV DNS-fragmcnt untok helyének megállapítása céljából. Úgy találtuk, hogy a következő, jelzett IIBV fragmentumok összhangban vannak a pRÍT10601 fragmentumok méretével: az 1450 és 1600 bp értékű BamHI fragmentum; egy 1330 bp értékű Hpal fragmentum; valamint egy 1130 bp értékű BamHI-XhoI fragmentum. Ha egy agaróz-gélről ezeket a fragmentumokat Southern [.I. Mól. Bioi., 98, 503 (1975)] eljárásával egy nitro-cellulóz szűrőre visszük, majd a pRITl0601 BamHI emésztésével az 1450 és 1600 bp értékű- fragmentumokat felszabadítjuk, akkor e fragmentumokkal a Dane-részecskéből származó, jelzett DNS is specifikusan hibridizál. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a kiónozott, pRITl 0601-be beépült DNS-rész (inszertum) reprezentálja a HBV-genomot, és a pRITl0601 -ben levő két BamHI fragmentum viszonylagos orientációja ugyanaz, mint a virionban. A pRIT10601 plazmidot alkalmaztuk az alábbi, 10. példában a pRITl 0671 előállítására. 2. példa pRIT10616 intermedier plazmid előállítása a HBV DNS és pACYC184 kombinálásával adw szerotípusú HBsAg-pozitív szérumból a fentebb leírt módon Dane-részecskéket izolálunk. A 32 P-vel jelzett HBV DNS restrikciós endonukleázzal végzett elemzése azt mutatja, hogy a DNS egyetlen EcoRI helyet tartalmaz. Endogén polimeráz reakcióval, nem-jelzett nuklcotidok alkalmazásával bel ölt öl I IIBV DNS-t EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztünk. Az így kezelt DNS-t a pACYC184 plazmiddal elegyítjük, amelyet előzőleg EcoRI enzimmel emésztettünk, és alkálikus foszfatázzal kezeltünk. (A pACYCI84 plazmid beszerzési korlátozás nélkül az American Type Cul*ure Collection-ban 37033 jegyzékszámmal nyert elhelyezést.) Ezután az elegyet T4 DNS-ligáz segítségével ligálási reakcióba hozzuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
