196625. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis-b vírus vakcina előállítására
5 190 625 6 kus íIBsAg-t specifikusan felismerik, es azzal reagálnak, vagy amelyeket anti-HBsAg antitestek specifikusan felismernek. A HBsAg-t kódoló szekvenciát fertőzött emberi szérumban levő Dane-részecskékbő! kivont DNS-ből úgy izolálhatjuk, hogy az egyszálii szakaszt valamilyen DNS-polimcrázzal, előnyösen az endogén polimerázzal kapcsolatba hozzuk, és ezt követően valamilyen restrikciós endonukleázzal emésztést végzünk. Az endonukleáz megválasztása részben az adott Danerészecskéktől függ. így például - amint ezt az alábbi példákban bemutatjuk bizonyos adw szero-típusú Da ne-részecskék bő! származó IIBV DNS HBsAg-l kódoló szekvenciája egyetlen BamlII fragmentumon elkülöníthető; más, ayw-szerotípusú Dane-részecskékből származó HBV DNS HBsAg-t kódoló szekvenciája egy I Ilia! fragmentumon izolálható. Ugyanazon szerotípusú Danc-részccskék IIBV DNS molekulája különböző restrikciós helyeket mutathat. A találmány szerinti eljárás megvalósítása során a DNS-nak DNS-fragmentumok előállítása céljából való restrikciója, a fragmentumoknak a találmány szerinti eljárásban alkalmazott, rekombináns DNS- molekulák előállítása céljából való megkötése és mikroorganizmusokba való inszertólása ismert módszerekkel — például az előbbiekben és a következőkben idézett irodalmi helyek közlései szerint — végezhetők. A körülményeket úgy választjuk meg, hogy a DNS és az enzimek denaturálását elkerüljük: így például a pH értékét 7,0 és ) 1,0 közötti területre pufferoljuk, és a hőmérsékletet 60 °C alatt tartjuk. A restrikciót előnyösen körülbelül 30-40 °C, a kötést körülbelül 0-10 °C hőmérséklettartományban végezzük. A találmány szerinti eljárást kereskedelmi forgalomból beszerezhető restrikciós enzimekkel és ligázokkal hajtjuk végre, és ezeket a megadott tájékoztatások szerint kell alkalmazni. A T4 DNS-ligáz használata előnyös. A llBsAg-szekvcnciának a szabályzó szakasszal való fúzióját (egyesítését) az alábbi példákban leírt, intermedier vektorok alkalmazásával valósíthatjuk meg. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy a HBsAg-szekvenciát közvetlenül inszertáljuk egy olyan vektorba, amely a szabályzó szakaszt tartalmazza. A vektor egy olyan DNS-molekula, amely a találmány szerinti DNS-fragmentumot — beleértve például a fágokat és plazmidokat is — hordozni és megtartani képes. A DNS-fragmentumoknak fágokban való klónozásának rnódszerét közölték például: Charnay és munkatársai [Nature, 286, 893 (1980)] és Tiollais (2 034 323 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás). A IIBsAg-szckvenciát a szabályzó szakaszhoz viszonyítva előnyösen úgy helyezzük el, hogy a HBsAg-szekvencia érvényesülésével szintetizált HBsAg idegen aminosavcsoportoktól mentes legyen. Úgy találtuk, hogy különösen alkalmas szabályzó szakasz származtatható az élesztőgomba arg 3 génjéből, amely az ornitín karbamoil-transzferáz enzimet (OCT enzimet) kódolja. Az arg 3 szabályzó szakaszának alkalmazása azért előnyös, mert aktivitását mind specifikus, mind általános kontrollmechanizmusok szabályozzák. E szabályzó szakaszt az E. coli-ban pYeura3arg3 plazmidon klónozták [Crabeel és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. 78, 5026 (I 981 )|. Előnyös gazdaszervezetei olyan S. cerevisiae törzsek, amelyekben az arginin bioszintézise derepresszált, így például az I cl 697d törzs. Ilyen törzsek alkalmazása az arg 3 promoter érvényesülésének fokozódását eredményezi, ha ezt összehasonlítjuk a példákban alkalmazott más törzsekkel, például a DC5 törzzsel. A fúzióba vitt (egyesített) DNS-fragmentumnak élesztőgombában való klónozásához előnyös vektor az YEpl3 plazmid, amely képes mind az E. coli-ban és S. cerevisiae-ban való replikációra és fennmaradásra, s amely „ingázó” vektorként ismeretes. Számos más élesztőgomba-vektor ismert és beszerezhető. A IIBsAg és a szabályzó szakasz egy élesztőgombavektorba egymást követően, vagy — amint ezt a példákban bemutatjuk — egyidejűleg inszertálhatók. A plazmid-vektorokkal történő transzformálás általában a találmány szerinti DNS molekula plazmidként való beépülését eredményezi. Egyéb reakciók — így például rekombinációs folyamatok — is eredményezhetik azonban a DNS-molckuíának kromoszóma- DNS-ba való beépülését. A HBV-fertőzésck elleni védelem serkentésére szolgáló, találmány szerinti, élesztőgomba által termelt HBsAg t és megfelelő vivőanyagot tartalmazó vakcinák ismert eljárásokkal előállíthatok. Kívánatos valamilyen adjuváns — például alumínium-hidroxid — alkalmazása. Az így termelt HBsAg kombinált vakcinák előállítása céljából más immunogénekkel is kombinálható. E HBV vagy kombinált vakcinák például szubkután, intravénás vagy intraniuszkuláris úton adagolhatok. A találmány szerinti DNS-fragmentum és az ennek segítségével termelt HBsAg felhasználhatók továbbá arra a célra is, hogy biológiai mintákban DNS-hibridizálási eljárással és különböző immunmeghatározásokkal HBV-t mutathassunk ki. A találmány szerinti eljárást részletesen ismertetjük az alábbi, nem korlátozó jellegű kiviteli példákban. E példákban a százalékok súlyszázalékokat jelentenek, a hőmérsékleteket °C-okban adjuk meg. 1. példa pRlT10601 intermedier plazmid előállítása a IIBV DNS és pBR322 kombinálásával ayw Szerotípusú IIBsAg-pozitív szérumot kalciumklorid hozzáadásával fibrinmentesítünk, és 0,28 % végkoncentrációra állítunk be, majd 2 órán át SW 27 típusú rotorban percenként 27 000 fordulatszámmal centrifugáljuk 10-20 % szaccharóz-sűrűséggradicnssel, amelyet 7,5 pH értékű, 10 mmól trometamin [(2- amino-2-(hidroxi-metil)-l ,3-propándiol] hidrokloridot, 1 mól nátrium-kloridot éa I mmól EDTA-t tartalmazó pufferrel készítettünk. A Dane-részecskéket tartalmazó, átlátszó pelletet ugyanilyen pufferoldatban reszuszpendátjuk, és 65 %-os, alsó rétegként elhelyezett szaccharózoldal fölé rétegezett, pufferolt 20 %-os szaccharózoldattal centrifugáljuk. Az alsó réteg határfelületén opaleszkáló csíkot találunk, amelyet a Dane-részecskék pelletté alakítása céljából 200 OOOXg sebességgel 4 órán át, hasonló 20—65 % szaccharóz-sűrűséggradicnssc! centrifugálunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
