196464. lajstromszámú szabadalom • Új eljárás 1,2-dehidro-szteroidok előállítására
6 196464 7 anyagot adjuk hozzá. A szteroid szubsztrétot porként vagy vízzel elegyedő szerves oldószerben (például dimetil-forraamidban, etanolban, metanolban, acetonban, dimetil-szulfoxidban) vagy vízzel nem elegyedő szerves oldószerben (például toluolban) oldva vagy szuszpendálva adjuk hozzá. c) A száraz sejteket kis mennyiségű pufferban rehidratáljuk további puffer vagy szerves oldószer hozzáadásával. A végleges 0-95% (tf/tf) eléréséhez etanolt, acetont, xilolt, butil-acetátot, metilén-kloridot vagy toluolt adunk hozzá. A használt aromás szénhidrogén mennyisége a legjobban oldódó szteroid feloldásához szükséges oldószer felétől a legkevésbé oldódó szteroid oldásához szükséges oldószer négyszerese között változhat. A reakció megindításához elektron átvivő anyagot és szteroidot adunk a reakcióelegyhez. Az aromás szénhodrogént előnyösen a szteroiddal együtt adjuk az elegyhez, bár ez egy korábbi vagy későbbi időpontban is megtörténhet. d) A nedves sejttömeget szuszpendáljuk vagy a fermentációs levet hígitjuk gyengén pufferolt vizes oldattal, majd egy exogén elektron átvivő anyagot, a szteroidot és egy aromás szénhidrogént adunk hozzá. A találmány szerinti reakcióban használható vegyületek a S-keto-a^-androsztén és a 3-keto-a*-pregnén tipusú szteroidokhoz tartoznak. A szteroid-l-dehidrogenéz szubsztrátjai az A gyűrű 1-es és 2-es szénatomja között telitettek, és az A gyűrű 3-as helyzetében hidroxil- vagy ketocsoportot tartalmaznak. Az androsztén-tipusű vegyületek közé az alábbiak tartoznak: 1) androszta-4-én-3,17-dion, 2) androszta-4,9(ll)-dién-3,17-dion és ezek 6-alfa-fluor-, 6-alfa-metil- vagy 16-metil-származékai, 3) ll-béta-hidroxi-androszta-4-én-3,17-dion -és származékai. A felhasználható S-keto-a^-pregnén-tipusű vegyületek közé az' alábbiak tartoznak: 1) 17-alfa-hidroxi-pregn-4-én-20-in-3-on és 16-metil-származékai, 2) ll-béta,21-dihidroxi-pregn-4,17 (20)-dién-3-on és 6-alfa-metil-származékai, 3) 20-klór-pregn-4,9(ll),17(20)-trién-21-al-3-on, 4) a 3,20-diketo-a*-pregnének számos csoportja, vagyis a) 11,17,21-trihidroxi-vegyületek, mint például a hidrokortizon és 6-alfa-metil-származéka, b) 9-béta,ll-béta-epoxi-17,21-vegyületek, mint például a 9-béta, ll-béta-epoxi-17,21-dihidroxi-15- -béta-metil-pregn-4-én-3,20-dion, c) 3,20-diketo-4,9(ll)-pergén-diének, mint például a 17-alfa,21- -dihidroxi-pregn-4,9( 11 )-dién-3,20-dion és ennek 16-alfa-metil—, 16-béta-metil- vagy 16-alfa-hidroxi-származékai vagy 17-alfa-acetát-észtere, d) 3,20-diketo-4,9(ll)-, 4,9(11),16--pregnén-triének, mint például a 21-hidroxi-pregn-4,9(ll),16-trién-3,20-dion és ennek 6-alfa-fluor-származéka. A 21-es helyzetben hidroxil-csoportot tartalmazó 2. és 4. pont alatti szteroidok 21- -észter származékai szintén alkalmazhatók szubsztrátként. Az előnyös 21-észterek az alacsonyabb szénatomszámú zsírsavakhoz hasonló alacsonyabb szénatomszámú alkil- vagy aril-csoportokat tartalmaznak, például ecetsavat vagy monociklikus karbonsavat, például benzoésavat. A biokonverzió terméke és az át nem alakult szubsztrát szokványos módszerekkel választható el a keverékből. A szteroidokat általában szűréssel, majd a szűrön maradt lepény szerves oldószerrel, mint például acetonnal vagy metilén-kloriddal való extrakciójával választják el. Egy másik alternativ módszer az, hgy az egész biokonverziós keveréket egy vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, mint például butil-acetáttal vagy metilén-kloriddal extrahálják, majd a terméket a szerves oldószerből különítik el. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal illusztráljuk, anélkül azonban, hogy a találmányt a példákra korlátoznánk. A példák is bizonyítják, hogy a találmány szerinti eljárás sokkal jobb az irodalomból ismert eljárásoknál. A biokonverziókat a fentiekben részletezett körülmények között hajtottuk végre. 1. példa Szárított sejtek előállítása 6-6 g/1 keményitócukrot, peptont és kukoricalekvárt tartalmazó (pH = 7,0) rázólombikokba Bacterium cyclooxydans-t (ATCC 12673) oltottunk. A kultúrákat 28 °C hőmérsékleten egy rotarázógépen inkubáltuk, amíg glükóz kimerülés nem lépett fel. Ekkor 0,5 g/1 kortizon-acetátot adtunk hozzá, és a lombikot további 16 órán keresztül inkubéltuk. A sejteket centrifugálással nyertük ki, kétszer vízzel mostuk, majd csökkentett nyomáson 45 °C hőmérsékleten megszárítottuk. 6-alfa-metil-kortizon biokon verziója A fenti módon előállított sejtekből fél grammot 50 ml 50 mmólos foszfát pufferben (pH = 7,5) rehidráltunk keverés közben. A sejtszuszpenzióhoz etanolos oldatban (8,6 mg/1 etanol) menadiont adtunk 0,025 ml/50 ml arányban. A szubsztrétot dimetil-formamidban (DMF) oldva (100 mg 6-alfa-metil-hidrokortizon/ml DMF) adtuk a végső 0,5 g/1 koncentrációjú biokonverziós elegy-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
