196462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás imun interferon előállítására
12 196462 13 37 °C-on 24 órán át folytatjuk. Ezután minden mélyedéshez 2000 TCIDso (TCIDso = közepes sejttenyészet fertőző dózis) koncentrációra beállított 50 /ul vesiculáris stomatitis virus (New Yersey törzs) készítményt adunk 5 és az inkubálást szén-dioxid inkubátorban 37 °C-on folytatjuk. Mintegy 35 óra elteltével, amikor az IFN mintát nem tartalmazó mélyedésben levő sejtek 100%-os CPE-t mutatnak, minden mélyedést a CPE meghatározása 10 céljából mikroszkopikusan megvizsgáljuk és az 50%-os CPE-t mutató mélyedésben levő IFN-minta higítási faktorának reciprokát tekintjük IFN-titernek. IFN~x minta gyanánt a humán perifériális limfocitás 40 pg/ml concanavalin A-val és 15 ng/ml 12-0-tetra-dekonal-forból-13-acetáttal történő stimulálása után 72 órával összegyűjtött felülúszót alkalmazunk. A fenti felülúszó tenyészet minden ml-re 4400 egység humán IFN-x-t (hővel és savval szemben labilis) tartalmaz. Ha az IFN-x-hoz kötődő kapacitást mutató anti-testek vannak jelen a klónozott sejt-tenyészet felülúszóban, úgy a hozzáadott IFN-x~nak a cellulózon az anti-testekhez kell kötődni és a felülúszó IFN-'y-aktivitásának csökkenni kell. A x 2-11 klón esetében az IFN-x-hoz való viszonylag intenzív kötődő kapacitás figyelhető meg és a hozzáadott IFN-x (550 E/ml) 50-75%-a az an- 15 ti-testekhez kötődik (3. táblázat). 3. tá blézat Monoklonális anti-testek IFN-y aktivitást megkötő hatása Hibridóma tenyészet .Maradék IFN aktivitás (E/ml) 1. kísérlet 2. kísérlet X 2-11.1 138 275 X 2-11.2 207 N.D. X 2-11.6 N.D. 275 X 2-62.2 275 550 •X 2-62.3 275 550 X 2-100.2 550 N.D. X 2-100.3 550 N.D.-550 550 7. példa Monoklonális antitest-termelő hibridómák ascites képzése Az ascites-képződést oly módon idézzük elő, hogy 0,5 ml ásványolajjal intraperitóniálisan előkezelt BALB/C egereket 1 x 106x 2- -11.1, IFN-x aktivitást megkötő anti-testek termelésére képest klón-sejtekkel intraperitóniálisan inokulálunk. A hibridómák intraperitóniális beadása után 10 nappal az ascitikus folyadékot levesszük és az antitest-aktivitást 107-szeres hígításig megvizsgáljuk. A megfelelő klón sejt-tenyészet felülúszó esetében anti-test aktivitás lO^-szeres hígításig figyelhető meg, ugyanakkor az ascites-képződés (ascitizáció) az anti-test aktivitás kb. 1000-szeres növekedéséhez vezet. 45 8. példa Monoklonális anti-test tisztítás Kiindulási anyagként 4 ml, a 7. példa 50 szerint kapott ascitikus folyadékot használunk és a monoklóniális anti-test tisztítást Staeelin és tsai módszerével végezzük el. (Journal of Biological Chemistry 256, 9750 /1981/). Az ascitikus folyadékot a fibrin-sze- 55 rü anyagok eltávolítása céljából előbb 10000 fordulat/perc sebességgel 15 percen át centrifugáljuk, majd foszfát-só pufferrel (PBS: 8,1 mM NaIl2P04, 1,5 mM KH2PO4, 2,7 mM KC1, 137 mM NaCl; pH 7,2) olyan kon- 60 centrációra hígítjuk, hogy az ultraibolya abszorbció 280 nm-nél (A280) 12 és 14 közötti érték legyen. A hígított mintához telített vizes ammónium-szulfát-oldatot adva a szulfát-koncentiációt 47%-ra állítjuk be. Az elegyet 65 4 °C-on 60 percen át keverve elvégezzük a 8
