196462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás imun interferon előállítására
14 196462 15 kisózást, majd centrifugáljuk (1000 fordulat/perc, 15 perc). A kapott csapadékot 50 mmól nátrium-kloridot tartalmazó 20 nimól trisz-pufferben (pH = 7,9) oldjuk és 2 1 fenti pufferrel szemben dializáljuk. 2 óra múlva a 5 dialízáló oldatot ugyanezen összetételű oldat friss 2 literes mennyiségével lecseréljük és a dialízist további 15 órán át folytatjuk. A kiváló csapadékot centrifugálással (10000 fordulat/ perc, 15 perc) eltávolítjuk és a felül- jo úszót olyan koncentrációra állitjuk be, hogy az A28ö 20-30 közötti érték legyen. A mintát 50 mmól nátrium-kloridot tartalmazó megfelelő mennyiségű trisz-puf.ferrel (pH = 7,9) egyensúlyba hozott DEAE-cellulóz ]5 oszlopon (8 ml, Wattman DE52) frakcionáljuk; az eluálást 50 mmól nátrium-kloridot tartalmazó trisz-pufferrel, 1,5 ml/perc átfolyási sebességgel végezzük el. A fenti körülmények között auti-test aktivitást főként a kifolyó frakciókban tapasztalunk. A SDS-PAGE-módszerrel (Laemlie és tsai: Nature 227, 680 /1970/) igazoljuk, hogy a tisztított minta ténylegesen az anti-test. Az ammónium-szulfátos kisózással és DEAE-cellulóz frakcionálással kapott frakciók közül néhányat 2-merkapto-etanollal redukálunk, majd 17%-os SDS gél-elektroforézisnek vetünk alá 24 órán át 30 volt feszültség mellett. Az anti-test aktivitás csúcsoknak megfelelően két sávot tapasztalunk, a kb. 55 kilodalton (H lánc) és kb. 28 kilodalton (L lánc) molekulatömegeknek megfelelő helyzetekben. Az ily módon tisztított anti-test frakció 17 IFN-ü-megkötó kapacitásának meghatározása céljából IFN-^-t adunk hozzá 12200 U/ml). Azt találtuk, hogy az IFN-"}i kb. 50%-a az anti-testhez kötődik (4. táblázat). 4. táblázat Minta Hígítás Maradék IFN aktivitás (ü/ml) y 2-11.1 frakció 17 IO'1 1100 io-2 1100 IO-3 2200 IO-4 2200 Anti-IgE monoklonális anti-test 10-1 2200 IO-2 2200 10-3 2200 10-4 2200 9. példa Al-osztály, amelyhez a monoklonális anti-testek tartoznak Tisztított anti-test frakciót (17 jelű) (8. példa) 10-szeresére hígítunk és agaron immuno-kicsapásos reakciónak vetjük alá (Ouchterlony teszt: Immunological Methods, Gel-Diffusion Techniques, Blackwell, Oxford, 1964) kecske anti-egér IgGl, G2a, G2b és G3 anti-testeket (Miles) alkalmazva úgy, hogy olyan IgG al-osztály legyen azonosítható, amelyhez y 2-11.1 monoklónikus anti-testek 50 tartozhatnak. A monoklonális anti-test és a kecske anti-egér IgG2b anti-test között egyetlen különálló sáv található, míg a monoklonális anti-test és a többi anti-anti-test között nem figyelhető meg sávképződés. En- 55 nek megfelelően a monoklonális anti-test az IgG2b-hez tartozik (5. táblázat). 9
