196462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás imun interferon előállítására
10 196462 11 2-100) intenzív antitest-aktivitást, míg két másik mélyedésben (k 2-62 és y 2-70) gyenge antitest-aktivitást figyeltünk meg. 5. példa Klónozás Három mélyedésből ("ü 2-11, y 2-62 és y 2-100) származó, pozitív antitest-aktivitást mutató mélyedésből származó hibridómákat a hatáshígitásos módszerrel klónozunk. A hibridóma sejteket RPMI1640-20FCS-ben legalább 2-hibridóma sejt/ml koncentrációban szuszpendáljuk és a szuszpenziót 96-mélyedést tartalmazó mikrolemez mélyedései között 0,1 ml részletekben elosztjuk. A fenti el- 5 osztásban tápsejtként minden mélyedéshez 5 x 105 BALB/C egér timocitát adunk. A fentiek eredményeként a sejtburjánzás kb. 2 hét múlva figyelhető meg. A felülúszót összegyűjtjük és az anti-testek jelenlétét a 3. 10 példában leírt EIA-módszerrel meghatározzuk. Antitest aktivitást tapasztalunk v 2-11 mélyedés 19 kiónja közül 8-ban, a y 2-62 mélyedés 54 kiónja közül 3-ban, és a ] 2-100 mélyedés 47 kiónja közül 5-ben (2. táblázat). 15 2. táblázat Klónozott hibridómák anti-peptid anti-test aktivitása Hibridóma száma B/T (%) y 2-11 1 68 ■ 2 31 3 63 6 68 7 67 9 69 12 42 18 60 K 2-62 14 20 16 21 34 16 Ti 2-100 2 69 3 70 16 56 25 80 46 33 Hiperimmun egér szérum 35 6. példa Monoklonális antitestek IFN-y-hez való kötődési kapacitása A monoklónikus antitestek IFN-^-hez való kötődési kapacitását az alábbi módszerrel határozzuk meg. Nyúl anti-egér IgG antitesttel kapcsolt cellulóz 3%-os oldatához (300 /ül) a y 2-11, y 2-62 és y 2-100 sejtek 3 klónozott sejtvonal tenyészetének felülúszóját (300 pl) adjuk és a reakciót szobahőmérsékleten 12-20 órán át folytatjuk. A cellulózt ezután fiziológiai konyhasó-oldattal alaposan mossuk és az alábbi eljárással nyert IFN-’jí-50 ból 550 ml-t adunk hozzá. A felülúszót 3-4 órás reakció után összegyűjtjük és az alábbi eljárással nyert IFN-^-t adunk hozzá. A felülúszót 3-4 órás reakció után összegyűjtjük 55 és az IFN-v aktivitást a citopatikus hatás (CPE) leolvasó módszerrel mokrilemez felhasználásával meghatározzuk. (Applied Microbiology 16, 1706 /1968/). 96 mélyedést tartalmazó mikrolemez minden mélyedésébe 50 ul gQ MEM-t helyezünk és az első mélyedésbe 50 m1 IFN mintát adunk, majd kétszeres sorozathígitást alkalmazunk. Minden mélyedéshez 50 ul WISH-féle sejt-szuszpenziót (4 x 105 sejt/ml) adunk 20% FCS-t tartalmazó MEM-ben és az 65 inkubélást szén-dioxid gáz inkubátorban 7
