196461. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immun interferon előállítására és tisztítására, valamint ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
14 196461 15 3. táblázat Monoklonális antitestek IFN-y aktivitást megkötő hatása Hibridóma tenyészet Maradék IFN aktivitás (U/ml) 1. kísérlet 2. kísérlet *2-11.1 138 275 *2-11.2 207 N.D. *2-11.6 N.D. 275 *2-62.2 275 , 550 *2-62.3 275 550 *2-100.2 550 N.D. *2-100.3 550 N.D.-550 550 7. példa Monoklonális antitest-termelő hibridómák ascites képzése Az ascites-képzódést oly módon idézzük elő, hogy 0,5 ml ásványolajjal intraperitoneálisan előkezelt BALB/C egereket lxlO6 *2- -11.1, IFN-* aktivitást megkötő antitestek termelésére képes klón-sejtekkel intraperitoneálisan inokulálunk. A hibridómák intraperitoneális beadása után 10 nappal az ascitikus folyadékot levesszük és az entitest-aktivitást 107-szeres hígításig megvizsgáljuk. A megfelelő klón sejt-tenyészet felülúszó esetében antitest aktivitás 104-szeres hígításig figyelhető meg, ugyanakkor az ascites-képződés (ascitizáció) az antitest aktivitás kb. 1000- -szeres növekedéséhez vezet. 8. példa Monoklonális antitest tisztítás Kiindulási anyagként 4 ml, a 7. példa szerint kapott ascitikus folyadékot használunk és a monoklonális antitest tisztítást Staeelin és tsai módszerével végezzük el [Journal of Biological Chemistry 356, 9750 (1981)]. Az ascitikus folyadékot a fibrinszerű anyagok eltávolítása céljából előbb 10 000 fordulat/perc sebességgel 15 percen ót centrifugáljuk, majd foszfát-só pufferrel (PBS: 8,1 mM NUH2PO4, 1,5 mM KH2PO4, 2,7 mM KOI, 137 mM NaCl; pH 7,2) olyan koncentrációra hígítjuk, hogy az ultraibolya abszorbció 280 nm-nél (A2S0) 12 és 14 közötti érték legyen. A hígított mintához telitett vizes ammónium-szulfét-oldatot adva a szulfát-koncentrációt 47%-ra állítjuk be. Az elegyet 4 “C-on 60 percen ét keverve elvégezzük a kisózást, majd centrifugáljuk (10 000 fordulat/perc, 15 perc). A kapott csapadékot 50 mmól nátrium-kloridot tartalmazó 20 mmól trisz-pufferben (pH = 7,9) oldjuk és 2 liter fenti pufferrel szemben dializáljuk. 2 óra múlva a dializáló oldatot ugyanezen összetételű oldat friss 2 literes mennyiségével lecseréljük és a dialízist további 15 órán át folytatjuk. A kiváló csapadékot centrifugálással (10 000 fordulat/perc, 15 perc) eltávolítjuk és a felülúszót olyan koncentrációra állítjuk be, hogy az A280 20-30 közötti érték legyen. A mintát 50 mmól nátrium-kloridot tartalmazó megfelelő mennyiségű trisz-pufferrel (pH = 7,9) egyensúlyba hozott DEAE-celiulóz oszlopon (8 ml, Wattman DE52) frakcionáljuk; az eluálást 50 mmól nátrium-kloridot tartalmazó trisz-pufferrel, 1,5 ml/perc átfolyási sebességgel végezzük el. A fenti körülmények között antitest aktivitást főként a kifolyó frakciókban tapasztalunk. A SDS-PAGE- módszerrel [Laemlie és tsai: Nature 227, 680 (1970)] igazoljuk, hogy a tisztított minta ténylegesen az antitest. Az ammónium-szulfátos kisózással és DEAE-cellulóz frakcionálássa! kapott frakciók közül néhányat 2-merkapto-etanollal redukálunk, majd 17%-os SBS gét-elektroforézisnek vetünk alá 24 órán ét 30 volt feszültség mellett. Az antitest aktivitás csúcsoknak megfelelően két sávot tapasztalunk, a kb. 55 kilodalton (H lánc) és kb. 28 kilodalton (L lánc) molekulatömegeknek megfelelő helyzetekben. Az ily módon tisztított antitest frakció 17 IFN-*-megkötö kapacitásának meghatározása céljából IFN-*-t adunk hozzá (2200 U/ml). Azt találtuk, hogy az IFN-* kb. 50%-a az antitesthez kötődik (4. táblázat). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 9
