196460. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén immun interferon fragmens és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
16 196460 17 W. példa A 8. példa szerinti eljárással tisztított kifolyó frakciókból 25 ml (65,3 mg) monoklonális antitestet egy éjjelen ét 0,1 mólos nátrium-hiiirogén-karbonáttal szemben (pH = = 8,3) dializálunk. Külön lombikban 25 ml AFFl-GEL 10-et (Bio-Rad) vízzel alaposan mosunk, üvegszűrő felhasználásával, 0,1 mólos nátrium-hid rögén-karbonát-oldatban szuszpendálva (pH = 8,3) és a .fenti antl-testtel összekeverjük. Az elegyet 4 órán ét 4 °C-on a reakció lejátszatása céljából enyhén keverjük, majd 4 °C-on egy éjjelen át állni hagyjuk. Az AFFI-GEL 10-t 0,1 mólos nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal (pH = 8,3) üvegszüró alkalmazásával alaposan mossuk. A gélhez 25 ml, 0,1 mól etanol-amint és 0,15 mól nátrium-klór időt tartalmazó oldatot (pH = 8,0) adunk. Az elegyet 4 °C-on egy órán ét rázatjuk a még visszamaradó reagélatlan aktiv csoportok blokkolása céljából. A gélt ezután PBS-el alaposan mossuk és 25 ml, 0,1% nátrium-azidot tartalmazó PBS-ben (0,01 mól/liter foszfát nétríum-kloridban, 8,5 g/1, pH = 7,0) szuszpendáljuk, A szuszpenziót 4 °C-on tároljuk. A hozzáadott anLitest és a szűrletben levő antitest mennyisége alapján azt találtuk, hogy az anLitest 2,35 mg/ml gél arányban kötődik a gélhez. Antitest oszlopként az ily módon kapott reakciótermékkel töltött oszlopot alkalmazunk. 11. példa Az rlFN-'X termeléshez E. coli RRI törzset alkalmazunk [pRK148cIts* pRC231/IFI- 9001 (e rekombináns organizmus szerkezetét a 99 084 sz. európai szabadalmi leírásban ismertették). A pRK248cIts és pRC231/IFl-900 plazmidok hőmérsékletre érzékeny Lambda-represszort és IFN-)f géneket tartalmaznak. Az rIFN-}f gének kifejezésre juttatása a Pl promoterrel való szabályozás alatt történik. Az E. coli RRl törzs [pRK248cltn, PRC231/IFI-900J egy éjszakás tenyészetét LB láptalajon 30 °C-on tenyésztjük. Az egyéjszakás tenyészet 1 literét kazamino-savakat tartalmazó minimális M-9 táptalajjal 10 literre hígítjuk. A .kazamino-savak * kazein hidrolizisével nyert, a mikrobiológiában felhasznált aminosav-keverékek. A .minimális M-9 táptalaj’ ugyancsak a mikrobiológiában használatos táptalaj, amelynek összetétele a következő: dinátrium-hidrogén-foszfát 6 g/1; kélium-dihidrogén-roszfát 3 g/1; nátrium-klorid 0,5 g/1; ammónium-klorid 1 g/1; 1 mól/liter koncentrációjú magnézium-szulfát-oldat 2 inl/1; 1 mól/liter koncentrációjú kulciumklorid-oldat 0,1 inl/1; 20%-os glükóz-oldat 0,1 ni 1/1; pH = 7,4. Logaritmikus növekedése mellett a tenyészet hőmérsékletét 30 °C-ról 42 °C-ra növeljük, majd a tenyésztést 42 °C-on 2-3 órán át folytatjuk. A baktériumokat centrifugálással összegyűjtjük és a baktériu in-tartalmú labdacsokat felhasználásig -20 °C-on tároljuk. A fermentáció és a feldolgozás minden műveletét a National Institutes of Health rekombináns DNS irányelveivel összhangban végezzük el. Az rlFN-i; szintetikus 131-116. C-terminális peptidjeinok monoklonális antitestjeit a fenti módszerrel készítjük el. Az rIFN-y tisztítására Mo 5(2-11.1 monoklonális antitestet alkalmazunk. A monoklonális antitest-oszlopot a 10. példában leírtak szerint készítjük el. Az rIFN-)f l,C-jód-ecetsavval történő karboximetilezését 6 mól guanidin-hidroklorid jelenlétében, a (3) irodalmi helyen leírtak szerint hajtjuk végre. A reagens fölöslegét C-8 fordított fázisú oszlopon történő nagynyomású folyadékkromatografalással Lávolitjuk el. A karboxipeptizádos bontást 0,2 mólos ammónium-hidrogén-karbonát-oldatban a (4) irodalmi helyen leírtak szerint végezzük el. A rIFN-i( CNBr-el történő kezelését (inetioninhoz viszonyítva 100-szoros moláris fölösleg) 70%-os hangyasavbnn az (5) irodalmi helyen leírtak szerint végezzük el. A CNBr peptideket C-18 fordított fázisú oszlopon nagynyomású folyadékkromatografáléssal választjuk el. A peptid eiuálását 0 és 70% közötti mennyiségű metil-cianidoL tartalmazó trifluor-ecetsav elegyekkel lineáris gradiens szerint végezzük el. A fehérje vagy peptid mintákat lezárt, nitrogénnel öblített, evakuált csövekben, 4% tioglikolsavat tartalmazó állandó forrásban levő sósavban 20-24 órán át hidrolizáljuk. Az aminosavanalizist a (6! irodalmi helyen leírtak szerint fluoreszcamin aminosav-analizétorban hajtjuk végre. A karboximetilezett fehérjék szekvencia analíziséhez a (7) irodalmi helyen leírtait szerint ABI (Applied Biosystem Inc.) gázfázisú szekvenciátort (470A) alkalmazunk, A PTH-amiriosavak mintáit a (8) irodalmi helyen leírtak szerint ultraszférikus ODS oszlopon fordított-fázisú nagynyomású folyadékkromalográfiával azonosítjuk. Valamennyi tisztítási lépést 4 °C-os hőmérsékleten végezzük el. 25 g fagyasztott sejtet háromszoros mennyiségű (75 ml) 7 mól/lileres guanidin-hidrokloridban szuszpendálunk (pH = 7), Az elegyet I órán át keverjük, majd 1 órán keresztül 30.000 g sebességgel centrifugáljuk. A felül elhelyezkedő folyadékot tízszeres mennyiségű, Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt konyhasó-oldallal (PBS) vagy 0,15 mólos nátrium-borát-pufferrel (pH = 9,5) hígítjuk, majd 30 percen keresztül 30.000 g sebességgel centrifugáljuk. Eljárhatunk oly módon is, hogy 25 g fagyasztott sejtet másfélszeres térfogatú (37,5 ml) 0,15 mólos nátrium-borát-pufferben (pH = 9,5) szuszpenálunk és 1 órán át keverünk. Az elegyet 30-30 mp-ig 5 ízben szonifikáljuk, majd 30.000 g sebességgel 1 órán át centrifugáljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
