196460. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén immun interferon fragmens és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
18 196460 19 A guanidin-hidrokloridos extrakcióból vagy szonifikációból származó, felül elhelyezkedő folyadékot forgó rázató gépen 25 ml kovasavval 1 órán át keverjük, majd PBS-el előmossuk. Az elegyet oszlopra visszük fel és az oszlopot összesen 20-30 oszloptérfogatnyi 1 mólos nátrium-klorid-oldattal mossuk. Az oszlopot 0,5 mól tetrametil-ammónium-kloridot tartalmazó 0,01 mólos nátrium-borát-pufferrel (pH = 8) eluáljuk. Az interferont kb. 200 ml oldószerrel eluáljuk és 4 részre osztjuk. Minden részletet PBS-el egyensúlyba hozott monoklonális anti-test (x2-ll.l) affinitás oszlopra viszünk fel (4 ml ágytérfogat). Az oszlopot 10 oszloptérfogatnyi PBS- pufferrel mossuk, majd 1 mólos guanidin-hidrokloriddal vagy 50%-os etilénglikollal [amely 1 mól nátrium-kloridot és 20 mmól nátrium-foszfát puffert (pH = 7,0) tartalmaz] eluáljuk. Az interferont az első 20 ml-el eluáljuk. Az SDS-PAGE elvégzése Laemmli módszerével történik (9. irodalmi hely). A fehérjét fluoreszcamin analízissel határozzuk meg, referens standardként kristályos marha-szérum-albumint alkalmazunk. Az interferon aktivitást a (10) irodalmi helyen leírt módon, vesicularis stomatitis virus és humán WISH sejtek felhasználásával, a citopatikus hatás inhibiciós assay segítségével határozzuk meg. Az összes interferon titert a részlegesen tisztított humán immun interferon referencia standardhoz viszonyítva, referens egység/ml formájában fejezzük ki. Az extrakciós tisztítási műveleteket a 6. táblázatban foglaljuk össze. Az össz-kitermelés 25-32% és a tisztítás mértéke 100-769- -szoros, az átlagos fajlagos aktivitás 1 x 107 egység/mg. Az rIFN-x össz-kitermelése a guanidines extrakció esetében 3-4- szer nagyobb. A tisztítási műveletek utolsó lépésének SDS-PAGE diagramját az 1. ábrán mutatjuk be. A guanidines. extrakcióval tisztított termék kb. 18.000 daltonnái (18K rIFN-x) egyetlen sávot mutat, míg a szonifikációs eljárás esetében kb. 15.000 daltonnái (15K rIFN-x) egy fősáv és kb. 17.000 daltonnál (l.A ábra) egy melléksáv jelentkezik. Nem-redukáló gélen a rlFN-'x dimer jei és oligomerjei is képződnek (l.B ábra). A 18K rIFN-x homogén és aminosav-öszszetétele a DNS szekvencia alapján várható összetételnek felel meg. A 15K és 18K rIFN-x aminosav-összetételét a 7. táblázatban tüntetjük fel. Automata gázfázisú fehérje/peptid szekvencia meghatározó készülékben néhány száz pikomól redukált és karboximetilezett 15K és 18K fehérje Edman-bomlást szenved. A 15K illetve 18K fehérjék első 32 és 26 maradékának amino8av-N-terminális szekvenciái a DNS szekvencia alapján vártnak felelnek meg (2. ábra). A szekvencia analízis első és harmadik ciklusában 14C-karboximetilezett ciszteineket mutattunk ki. N-terminális metionint nem mutattunk ki. A 18K és 15K rIFN-x N-terminális szekvencia analízise azt mutatja, hogy mindkét fehérje esetében e tartományok szekvenciája a DNS szekvencia alapján, várttal azonos. A fenti tartományban fellépő esetleges kiesések vagy változások meghatározása céljából a C-terminális peptideket is jellemezzük. A karboxipeptidáz A (CPA) által megbontott elegy aminosav analízise azt mutatja, hogy a 18K rIFN-x-ból szerin és/vagy glutamin (C-terminális aminosavak) szabadul(nak) fel, ugyanakkor azonban azonos körülmények között a CPA a 15K rIFN-x-t nem bontja. Minthogy a Ser-Gin képezi a rIFN-x C-terminális szekvenciáját, a 18K species intakt C-terminust tartalmaz, míg a 15K species esetében a C-terminális maradék (Lys) ettől eltérő és CPA nem bontja. A DNS-szekvencia alapján várható C-terminális maradékok további bizonyítása céljából a C-terminális peptideket CNBr-es kezelés után analízisnek és szekvencia-meghatározásnak vetjük alá. A C-terminális peptideket C18 fordított-fázisú oszlopon nagynyomású folyadékkromatográfiával választjuk szét (3. ábra). A 15K rIFN-x esetében a gradiens korai részéből eluálva erős peptid csúcsot (II. csúcs) nyerünk és ez a peptid a 18K rIFN-x CNBr-el történő megbontása után kapott keverékben nincs jelen. A fenti peptid aminosav-analizis alapján homoszei’int vagy homoszerin-laktont nem tartalmaz . és ezért a 15K fehérje C-terminális CNBr peptidjének tekintendő. A fenti fehérje aminosav-analizis alapján (8. táblázat) az IFN-x 121-131 sz. aminosav-maradékának felel meg (arginin nem mutatható ki). A 11 aminosav szekvenciáját szekvencia-analízissel igazoljuk (2. ábra). A 18K rlFN-X- esetében az eluálás korai részében viszonylag széles csúcsot kapunk, amelyet sekély gradienssel két csúcsra választunk szét. Az aminosav analízis azt mutatja, hogy az első csúcs a 18K fehérje CNBr C-terminális peptidje (8. táblázat) és az aminosav-öszszetétel a 138-146. aminosav-maradéknak felel meg. A 9 aminosav szekvenciáját szekvencia-meghatározással igazoljuk (2. ábra). A 15K fehérje C-terminális aminosava a meghatározás alapján lizin. A fenti eredmények igazolják, hogy a 18K fajta az érintetlen rIFN-x molekula, míg a 15K fajta a proteolítikus termék. A 131 sz. aminosav és a 132 sz. aminosav maradékai közötti peptid kötést (Lys-Arg) a 15K fajtán hasítjuk el. 12. példa Az immun interferon 15K fragmensét a más fragraenseket (pl. a 17K fragmenset) tar-11 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
