196460. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén immun interferon fragmens és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
12 196460 13 37 °C-on 24 órán át folytatjuk. Ezután minden mélyedéshez 2000 TCIDs (TCIDso = közepes sejttenyészet fertőző dózis) koncentrációra beállított 50 /ul vesiculéris stomatitis virus (New Yersey törzs) készítményt adunk és az inkubálást szén-dioxid inkubátorban 37 °C-on folytatjuk. Mintegy 35 óra elteltével, amikor az IFN mintát nem tartalmazó mélyedésben levő sejtek 100X-os CPE-t mutatnak, minden mélyedést a CPE meghatározása céljából mikroszkopikusan megvizsgálunk és az 50%-os CPE-t mutató mélyedésben levő IFN-minta hígítási faktorának reciprokát tekintjük IFN-titernek. IFN-< minta gyanánt a humán perifériális limfociták 40 jug/ml concanavalin A-val és 15 ng/ml 12-0-tetra-dekanoil-forból-13-acetáttal történő stimulálása után 72 órával öszszegyűjtött felülószót alkalmazunk. A fenti felülúszó tenyészet minden ml-e 4400 egység 5 humán lFN-<-t (hővel és savval szemben labilis) tartalmaz. Ha az IFN-<-hoz kötődő kapacitást mutató antitestek vannak jelen a klónozott sejt-tenyészet felülúszóban, úgy a hozzáadott tFN-<-nak a cellulózon az anti- 10 testekhez kell kötődni és a felülúszó IFN— if— -aktivitásának csökkenni kell. A <2-11 klón esetében az IFN-< viszonylag intenzív kötődő kapacitása figyelhető meg és a hozzáadott IFN-< (550 E/ml) 50-75%-a az antitestekhez 15 kötődik (3. táblázat). 3. táblázat Monoklonális antitestek IFN-y aktivitást megkötő hatása Hibridóma tenyészet Maradék IFN aktivitás (E/ml) 1. kísérlet 2. kísérlet-<2-11.1 138 275 •<2-11.2 207 N.D. <2-11.6 N.D. 275 <2-62.2 275 550 <2-62.3 275 550 <2-100.2 550 N.D. <2-100.3 550 N.D.-550 550 7. példa Monoklónális antitest-termelő hibridómak ascites képzése Az ascites-képzódést oly módon idézzük elő, hogy 0,5 nd ásványolajjal intraperitoneálisan előkezelt BALB/C egereket 1 x 10° <2-11.1, IFN-< aktivitást megkötő anti-testek termelésére képes klón-sejtekkel intraperitoneálisan inokulálunk. A hibridómák intraperitoneális beadása után 10 nappal az ascitikus folyadékot levesszük és az antitest-aktivitást 107-szeres higitásig megvizsgáljuk. A megfelelő klón sejt-tenyészet felülúszó esetében antitest aktivitás 104-szeres hígításig figyelhető meg, ugyanakkor az ascites-kópzödés (ascitizáció) az antitest aktivitás kb. 1000-szeres növekedéséhez vezet. 8. példa Monoklónális antitest tisztítás Kiindulási anyagként 4 ml, a 7. példa szerint kapott ascitikus folyadékot használunk és a monoklónális anti-test tisztítást 40 Staeelin és kársai módszerével végezzük el (Journal of Biological Chemistry 256, 9750 (1981)1. Az ascitikus folyadékot a fibrinszeríi anyagok eltávolítása céljából előbb 10.000 fordulat/perc sebességgel 15 percen 45 át centrifugáljuk, majd foszfát-só pufferrel (PDS: 8,1 inM NallzPOí, 1,5 inM KHzPOn 2,7 niM KCl, 137 mM NaC); pH 7,2) olyan koncentrációra higitjuk, hogy az ultraibolya abszorbció 280 nm-nél (Azao) 12 és 14 közötti 50 érték legyen. A higitott mintához telített vizes ammónium-szulfáL-oldalol adva a szulfátkoncentrációt 47%-ra állítjuk be. Az elegye!. 1 °C-on 60 percen át keverve elvégezzük a kisózást, majd Centrifugáljuk (10.000 fordu- 55 lut/perc, 15 perc). A kapott csapadékot 50 ininól nátrium-kloridot tartalmazó 20 inmól trisz-pufferbeu (pH = 7,9) oldjuk és 2 liter fenti pufferrel szemben dializáljuk. 2 óra múlva a dializáló oldatoL ugyanezen összeté- 00 telü oldat friss 2 literes mennyiségével lecseréljük és a dialízist további 15 órán át folytatjuk. A kiváló csapadékot centrifugálással (10.000 fordulat/perc, 15 perc) eltávolítjuk és a felülúszó!, olyan koncentrációra 65 8
