196460. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén immun interferon fragmens és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
10 196460 11 6000-t (Koch) adunk hozzá és az elegyet 37 °C-os meleg víztartályban 7 percen át állni hagyjuk, mikoris a sejt-fúzió lejátszódik. Ezután 2 ml/perc sebességgel MEM-t adunk hozzá. Az összesen 12 ml MÉM hozzáadása után kapott elegyet 600 fordulat/perc sebességgel 15 percen át centrifugáljuk, majd a felül elhelyezkedő folyadékot eltávolítjuk. A sejt-üledéket 10% magzati borjú szérummal kiegészített RPMI-1640 táptalajban (RPMI 1640-10FCS) szuszpendáljuk 2 x 105 * P3U1 sejt/ml koncentrációban és 24-mélyedéses multi-csészékben (Linbro) levő 144 mélyedést 1-1 ml szuszpenzióval beoltunk. A beoltás után a sejteket 37 °C-on 5% szén-dioxid-gázt tartalmazó inkubátorban 37 °C-on inkubáljuk. 24 óra elteltével HAT-szelektív tenyésztést indítunk meg oly módon, hogy HAT-tal (1 x IO-4 M hipoxantin, 4 x 10”7 M aminopterin, 1,6 x 10*5 M timidin) kiegészített RPMI 1640-10FCS táptalajt adunk hozzá, 1 ml/mélyedés mennyiségben. A HAT-szelektív tenyésztést folytatjuk, miközben a starttól számított 3., 5. és 7. napon 1 ml régi tenyészetet 1 ml HAT-közegre cserélünk le. A hibridómák növekedését a sejt-fúzió után 10-14 nappal figyeljük meg. Mihelyt a fermentlé színe sárgába megy át (kb. 1 x 10® sejt/ml) a felülúszót összegyűjtjük és az anti-test jelenlétét az EIA-módszerrel megvizsgáljuk. A fenti módon 141 olyan mélyedést vizsgálunk meg, amelyben hibridóma növekedést megfigyeltünk. Két mélyedésben <82-11 és 82-100) intenzív antitest-aktivitást, még két másik mélyedésben {"82—62 és 82-70) gyenge antitest-aktivitást figyeltünk meg. 5. példa Klónozás Három mélyedésből (82-11, 82-62 és 82- 100) származó, pozitív antitest-aktivitást mutató mélyedésből származó hibridómákat a határhlgitásos módszerrel klónozunk. A hibridóma sejteket RPMI 1640-20FCS-ben legalább 2-hibridóma sejt/ml koncentrációban szuszpendáljuk és a szuszpenziót 96-mélyedést tartalmazó mikrolemez mélyedései között 0,1 ml részletekben elosztjuk. A fenti elosztásban tápsejtként minden mélyedéshez 5 x 105 BALB/C egér timocitát adunk. A fentiek eredményeként a sejtburjánzás kb. 2 hét múlva figyelhető meg. A felülúszót összegyűjtjük és az antitestek jelenlétét a 3. példában leirt EIA-módszerrel meghatározzuk. Antitest aktivitást tapasztalunk 82-11 mélyedés 19 kiónja közül 8-ban, a 82-62 mélyedés 54 kiónja közül 3-ban, és a 82-100 mélyedés 47 kiónja közül 5-ben (2. táblázat). 2. táblázat Klónozott hibridómák anti-peptid antitest _________________aktivitása_________________ Hibridóma száma B/T (%) 82-11 1 68 2 31 3 63 6 68 7 67 9 69 12 42 18 60 82-62 14 20 16 21 34 16 82-100 2 69 3 70 16 56 25 80 46 33 Hiperimmun egér szérum 35 6. példa Monoklónális antitestek IFN-y-hez való kötődési kapacitása A monoklónális antitestek IFN-8-hez való kötődési kapacitását az alábbi módszerrel határozzuk meg. Nyúl anti-egér IgG antitesttel kapcsolt cellulóz 3%-os oldatához (300 /ul) a 82-11, 82-62 és 82—100 sejtek 3 klónozott sejtvonal tenyészetének felülúszóját (300 pl) adjuk és a reakciót szobahőmérsékleten 12- -20 órán át folytatjuk. A cellulózt ezután fiziológiai konyhasóoldattal alaposan mossuk és az alábbi eljárással nyert IFN-8-ból 500 U/ml-t adunk hozzá. A felülúszót 3-4 órás reakció után összegyűjtjük és az alábbi eljárással nyert IFN-8’-t adunk hozzá. A felülúszót 3-4 órás reakció után összegyűjtjük és az IFN-8 aktivitást a citopatikus hatás (CPE) leolvasó módszerrel mikrolemez felhasználásával meghatározzuk [Applied Microbiology 16, 1706 (1968)]. 96 mélyedést tartalmazó mikrolemez minden mélyedésébe 50 pl MEM-L helyezünk és az első mélyedésbe 50 pl IFN mintát adunk, majd kétszeres sorozathígitást alkalmazunk. Minden mélyedéshez 50 pl WISH-féle sejt-szuszperiziót (4 x 10s sejt/ml) adunk 20% FCS-t tartalmazó MEM-ben és az inkubálást szén-dioxid-gáz inkubátorban 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
