196460. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén immun interferon fragmens és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
Találmányunk 2 19Ü46U 3 Cys Tyr Cys Gin Asn Leu Lys Lys Val Ala Asp Asn Lys Asn Trp Lys Gin Ser Gin Ile Lys Asn Phe Lys Val Glu Thr Ile Phe Asn Ser Asn Lys Leu Thr Asn Gin Arg Lys Alá Alá Glu Leu Ser Asp Pro Tyr Va! Tyr Phe Asn Alá Gly Thr Leu Phe Glu Glu Ser Asp Val Ser Phe Tyr Asp Asp Gin Ser Lys Glu Asp Met Lys Lys Lys Arg Tyr Ser Val Thr Ile His Glu Leu Pro Alá Alá Lys Lys Glu Alá Glu Gly His Ser Asp Leu Gly [le Leu Arg Lys Ile Met Phe Lys Leu Phe lie Gin Lys Ser Asn Val Lys' Phe Asp Asp Phe Glu Asp Leu Asn Val Ile Gin Val Met Thr Gly Lys aminosav-szekvenciával rendelkező - mely szekvencia az amino-végcsoporton adott esetben további metionin-maradékot tartalmazhat -, más peptidekt.ől mentes és a gamma-interferonnal lényegében azonos aktivitású polipeptid és a fenti polipeptidet tartalmazó gyógyászati készítményekre előállítására vonatkozik. Találmányunk tárgya eljárás a fenti polipeptidnek IFN-^-t tartalmazó transzformált mikroorganizmusból történő előállítására. Az eljárás szerint a transzformált mikroorganizmust a sejtek felszakítása után (pl. szonifikáció vagy kémiai lizis segítségével) proteáz-inhíbitor távollétében extraháljuk és a kapott extraktumot monoklonális anti-testek felhasználásával immun interferonná tisztítjuk. Az ábrák rövid ismertetése 15 ugyanezen készítményből történő extrakciójára és tisztítására. Az ismert tisztítási eljárások extrakciós lépése során a mikroorganizmust mechanikus (azaz szonifikáció) vagy kémiai lizisnek ve- 20 tették alá, amelynek során - gyakran rekombináns módszerek útján - nyerték a kivént .idegen' fehérjét. A mechanikai vagy kémiai lizis-módszerek során azonban a keverékbe különböző sejt-proteázok is bekerülnek. E 25 proteázok ezután enzimes behatás révén lebonthatják a keverékben levő .idegen" fehérjét. Az irodalom szerint az immun interferon bizonyos aminosav szekvenciái a virus-elle- 30 nes aktivitás szempontjából nem lényegesek, így pl. Capon és társai közleménye szerint (11. sz. közlemény) a rlFN-'ü 136-146. aminosavai a vírus-ellenes hatás szempontjából nem esszenciálisak. 35 Az 1. ábrán tisztított rekombináns humán immun interferon nátrium-dodecil-szulfát (poliakrilamid gél elektroforézisét- (a továbbiakban SDS-PAGE) mutatjuk be reduktív /A; 0,7 mól (j-merkapto-etanol/ és 40 nem redukáló (B) körülmények között. A 2. ábrán a rekombináns humán immun interferon várható aminosav-frekveneiáját a 15K és 18K rlFN-tf species tényleges DN5 szekvenciájával hasonlítjuk össze. 45 A 3. ábrán a 15K és L8K rlFN-'x C-terminális peptidjeinek HPLC elválasztásét mutatjuk be CNBr kezelés után. Az irodalomban számos módszert ismertettek az interferon néven ismert virus-el- 50 lenes fehérje-család extrakciójára és tisztítására. Jelen ismereteink szerint három főbb interferon-típust különböztetünk meg: IFN-oC (leukocita), IFN-/3 (fibroblaszt) és IFN-y (immun). Bár a különböző interferon-típusok vi- 55 rus-ellenes és burjánzásgátló hatásuk vagy szerkezeti felépítésük alapján összefüggnek, az irodalomban eddig egyetlen egységes módszert sem ismertettek mindhárom interferon-típus extrakciójára és tisztítására. A le- 60 ukocita-interferonnak más fehérjéket és sejtmaradványokat tartalmazó nyers keverékből történő extrakciójára és tisztítására felhasználható módszerek valójában nem alkalmasak fibroblaszt vagy immun interferonnak 65 A találmány előnyös foganatosítási módjainak ismertetése Azt találtuk, hogy immun interferon esetében a szokásos extrakciós módszerekkel (pl. az iroalomban leírt, szonifikáció vagy mechanikai lizis) nem nyerhető intakt vagy teljes aminosav-szekvenciával rendelkező immun interferon. A rekombináns technológia csupán a közelmúltban ért el olyan fejlettségi fokot, amelynek segítségével a jellemzéshez és aminosav-szekvencia meghatározáshoz elegendő mennyiségű rlNF-^ állítható elő. Az rlNF-í készítmények szokásos módszerekkel történő extrakciója és a tisztított anyag aminosav-szekvenciéjának meghatározása során azt találtuk, hogy a tisztított készítmény többfajta különböző molekulatömegű fehérjefajlát tartalmaz. Az aminosav-szekvencia meghatározása során azt találtuk, hogy ezek a fehérje-fajták ténylegesen az immun-interferon intakt szekvencia formájának az intakt szekvencia fehérjék proteolitikus fragmentjeivel képezett kombinációjából állnak. Meglepő módon bár felismerésünk érteimében a technika állása szerinti keverék intakt immun interferon fehérjét és fragmenseit egyaránt tartalmaz, azt találtuk, hogy a keverék egyik komponense biológiai aktivitását nyilvánvalóan megtartja. 3
