196460. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén immun interferon fragmens és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
-1 196460 A humán rlFN-^-nak az e fehérjét termelő és tartalmazó transzformált mikroorganizmusokból történő extrakcióját szonifikáció vagy mechanikai lizis felhasználásával egyszerűen és hatékonyan elvégezhetjük. Feltételezésünk szerint azonban proteázok az extrakciós lépés alatt lebontják az rIFN-ü-t. A fagyasztott sejtek szonifikációja során proteolitikus termékek keverékét kapjuk, így pl. 15K rlFN-'íf-t (molekulatömeg kb. 15 000 dalton; a találmányunk szerinti vegyület) amely a 132-146 sz. C-terminólis aminosav-maradékok lehasadása útján jön létre. Azt találtuk, hogy a 15K ríFN-ü tisztítás után más proteolitikus fragmentektól mentes és biológiai aktivitása lényegében a teljes 18K rIFN-ü fehérjéével (107 egység/mg) azonos és a homogén természetes humán immun interferonéval (7. sz. irodalmi hely) összehasonlítható. A 15K fehérje aniinosav-összetétele és N-terminális szekvenciái a DNS szekvencia alapján vártaknak felelnek meg. A 2. ábrán a 15K rIFN-u-aminosavat és a megfelelő DNS szekvenciát, valamint a teljes immun interferon fehérje aminosavat és megfelelő DNS szekvenciáját mutatjuk be. A teljes 18K humán rIFN-ü DNS bázis szekvenciáját a leírásban az 1. sz. irodalmi helyen leírtaknak megfelelően alkalmazzuk. Az extrakciós eljárásoktól függően az rlFN-'ü különböző molekulatömegű fajtáit (kb. 15.000-18.000 dalton) külön tisztítjuk. A 18.000 látszólagos molekulatömegü [ nátrium-dodecil-szulfát/poliakrilamid gól elektroforézis szerint] tisztított interferont guanidines extrakcióval nyerjük. Az alacsony 15.000 molekulatömegű immun interferon fajtát azonban előnyösen guanidin távollétében végzett szonifikációval extraháljuk. Mind a 18K, mind a 15K fehérje amino terminális szekvenciája összhangban áll a humán immun interferon fehérje DNS kódolása alapján várt szekvenciával. Ugyancsak találmányunk körébe tartozik az amino-végcsoporton a cisztein (Cys) előtt metionin (Met) maradékkal kezdődő polipeptid előállítása is. A 18K és 15K fehérje C-terminális szekvenciáit a CNBr kezelés után nyert tisztított C-terminális peptid analízisével és szekvenciájának megállapításával határozzuk meg. A 18K rIFN-ü-ból felszabadított C-terminális peptid aminosav-összetétele és szekvenciája az rIFN-ü várt szekvenciájával összhangban áll és ez azt jelzi, hogy a 18K fajta az intakt molekula. Ezzel szemben a 15K rIFN-ü C-végcsoportjából CNBr hasítással más peptid szabadul fel. Az aminosav-összetétel és szekvencia meghatározás alapján ez az eltérő peptid felel meg a 121-131. aminosav-maradékoknak és ez arra utal, hogy a 15K fajta a proteolitikus termék. A találmányunk szerinti eljárás előnyös foganatositási módja szerint a fermentációs műveletnél recipiensként az Escherichia coli K-12 294 törzset alkalmazzuk, feltéve, hogy mást nem közlünk. Ezt a törzset a 2 055 382A sz. brit szabadalmi bejelentésben Írták le és az American Type Culture Collection intézménynél 1978. október 28-én ATCC 31446 számon deponálták. Minden rekombináns DNS műveletet a National Institutes of Health irányelveinek megfelelően végeztünk el. Találmányunkat azonban nem korlátozzuk a fent említett E. coli K-12 294 törzs alkalmazására, hanem eljárásunk során más ismert E. coli törzsek (pl. E. coli MA210 vagy E. coli RR1 (ATCC 31 343)] vagy más mikroorganizmusok is felhasználhatók, amelyek sok képviselője bárki számára hozzáférhető, vagy deponálásra került, és elismert mikroorganizmus letétbehelyező intézmények útján beszerezhető ( pl. American Type Culture Collection, lásd ATCC katalógus). Az .interferon aktivitás' kifejezés az interferonok jellemző virus-ellenes és növekedés-ellenes aktivitására utal. Az rlFN jellemző vírus-ellenes aktivitását a Familletti P.C. és társai által leírt citopatikus hatásgátló teszttel határozzuk meg [Methods in Enzymology 78, 378 (1981)]. Az rlFN jellemző növekedés-ellenes aktivitásét Evinger és Pestka módszerével határozzuk meg [Methods in Enzymology 79, 45 (1981)]. A rIFN-ü C-végcsoportjának utolsó 16 aminosav-raaradékát tartalmazó szintetikus polipeptid monoklónólis antitestjeit állítjuk elő. A rIFN-u tisztítására az egyik monoklonális antitestet alkalmazzuk (Mo n 2-11.1). A találmány során a monoklonális antitesteket és az antitest affinitásos oszlopot a 103 898 sz. európai szabadalmi leírásban foglaltak szerint készítjük el. A találmányunk szerint előállított új immun interferont az egyéb ismert interferonokkal azonos célokra használhatjuk (pl. vírusos vagy neoplasztikus rendellenességek megelőzése és kezelése vagy immunoszupressziv állapotok kezelése). A találmányunk szerinti új immun interferont gyógyászatilag alkalmas orális, injekciós vagy helyi kezelésre szolgáló készítmények alakjában alkalmazhatjuk. A dozirozás és dózis-tartomány az ismert interferonok klinikai alkalmazása során használt értékeknek felel meg (általában napi 1-200.106 egység). A találmányunk szerint előállított gyógyászati készítmények a korábbiakban ismertetett immun interferont és gyógyászatilag alkalmas hordozóanyagot tartalmaznak. A készítmények előállításához bármely alkalmas és szokásos hordozóanyagok felhasználhatók. E célra szerves vagy szervetlen, enterális, perkutáns vagy parenterális adagolásra alkalmas hordozóanyagokat (pl. vizet, zselatint, gumiarábikumot, laktózt, keményítőt, magnézium-sztearátot, talkumot, növényi olajokat, polialkilénglikolokat, vazelint stb.) alkalmazhatunk. A gyógyászati készítmények ezenkívül további gyógyászati hatóanyagokat tartalmazhatnak. Ezenkívül a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
