196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
18 196457 19 ekben ismertetett módon Ti DNS-ligázzal kapcsoltuk össze. A reakcióelegyben jelenlevő DNS-at felhasználtuk a megfelelő Escherichia coli K-12 294 törzs transzformálására, a szokásos módszerekkel (Hershfield és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 71, 3455-3459 /1974/). A baktériumokat LB (Luria-Bertani) lemezekre vittük fel, amelyek 20 pg/ml ampicillint és 5 pg/ml tetraciklint tartalmaztak. Néhány, tetraciklinre rezisztens tenyészetet kiválasztottunk, a plazmid DNS-at elkülönítettük, és a kívánt töredék jelenlétét restrikciós enzimmel végzett analízissel igazoltuk. A kapott plazmid jelölése: pBRHtrp. A hepatitisz B virus genóm EcoRI és BamHI enzimekkel a szokásos módon kapott feltárási terméket a pGH6 plazmid (ATCC 31539) EcoRI és BamHI helyeibe klónoztuk (Goeddel és munkatársai, Nature, 281, 544 /1979/). Ekkor a pHS32 plazmidot kaptuk. Ez utóbbit Xbal enzimmel hasítottuk, fenollal extraháltuk, kloroformmal extraháltuk, és a terméket etanollal kicsaptuk. Ezután 1 pl Escherichia coli DNS-polimeráz I Klenow töredékkel (Boehringer-Mannheim) kezeltük 30 pl polimeráz pufferoldatban (összetétele: 50 mM kálium-foszfát, pH = 7,4; 7 mM magnézium-klorid, 1 mM béta-merkapto-etanol) 0,1 mM dTTP és 0,1 mM dCTP jelenlétében, 30 percig 0 °C-on, majd 2 órán át 37 °C-on. E kezelés hatására az Xbal hasítási hely 5’-nél túlnyúló végénél lévő négy kiegészítő nukleotid közül kettő belép a 3’ véghez: 5’ CTAGA----------- 5’ CT AGA-------3’ • T--------- 3’ TCT---------Két nukleotid, dC és dT beépült, és az 5’ végződésnél ekkor két túlnyúló nukleotid maradt. A pHS32 plazmidnak ezt a lineáris maradékát (fenolos és kloroformos extrakció, majd vízből etanolos kicsapéssal történő kinyerés után) EcoRI enzimmel hasítottuk. A nagy plazmidtöredéket poliakrilamidgél-elektroforézissel választottuk el a kisebb EcoRI-Xbal töredéktől, és elektroelúcióval elkülönítettük. Ezt a pHS32 plazmidból származó, 0,2 pg mennyiségű DNS töredéket a fentebb leírtakhoz hasonló körülmények között a pBRHtrp plazmidból készitett triptofán operon mintegy 0,01 pg mennyiségű EcoRI-Taql töredékével kapcsoltuk össze. A pHS32 töredékét az EcoRI-Taql töredékhez kapcsoló eljárás során a Taql- túlnyúló véget kapcsoljuk az Xbal megmaradt túlnyúló véghez, jóllehet nem áll fenn tökéletes Watson-Crick bázispárosítás: —T CTAGA-----+ — \ — TCTAGA■AGC TCT------) AGCTCTEnnek az összekapcsoló reakcióelegynek egy részét Escherichia coli K-12 294 törzs sejtjeibe transzformáltuk, hökezeltúk és ampicillint tartalmazó LB lemezekre vittük át. 24 tenyészetet választottunk ki, 3 ml LB (Luria-Bertani) táptalajon szaporítottuk és a plazmidot elkülönítettük. Hat esetben tapasztaltuk azt, hogy az Xbal hely regenerálódott az Escherichia coli által katalizált DNS párosítás és reprodukciós útján:-------TCTAGA----------- --------TCTAGA------------------>------- AGCTCT-------- -------- AGATCT------Ezek a plazmidok mind EcoRI, mind pedig Hpal enzimmel hasíthatok, és a várt restrikciós töredékeket szolgáltatják. Az egyik, pTrpl4 jelzésű plazmidot felhasználtuk heterológ polipeptidek termelésére az alábbiakban ismertetett módon. A pHGH 107 plazmid (ATCC 31538) (Goeddel és munkatársai, Nature, 281, 544 /1979/) az emberi növekedési hormonra vonatkozó gént tartalmaz, amely 23, szintetikus DNS töredékekből származó aminosav kodonból és 163 olyan aminosav kodonból áll, amely kiegészítő DNS-bói képződött az emberi növekedési hormon üzenethordozó ribonukleinsavjának fordított átírása útján. Ez a gén - jóllehet hiányzanak belőle az emberi növekedési hormon .elő’ szekvenciájának kodon jai tartalmaz egy ATG lefordítást kiváltó kodont. A gént 10 pg pHGH 107 plazmidból különítettük el EcoRI enzimmel végzett kezeléssel, majd Escherichia coli DNS polimeráz I Klenow töredékkel, dTTP-vel és dATP-vel végzett kezeléssel, a fentebb tárgyalt módon. Fenolos és kloroformos extrakció és etanolos kicsapás után a plazmidot BamHI-vel kezeltük. Az emberi növekedési hormon (HGH) génjét tartalmazó töredéket poliakrilamidgél-elektroforézissel, majd elektroelúcióval különítettük el. A kapott DNS töredék a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztosító szerkezeti gén első 350 nukleotidját is tartalmazza, azonban hiányzik belőle a tetracikün promotor-operátor rendszer, és igy ha termelő plazmídba klónozzuk, a betétet tartalmazó plazmidok lokalizálhatok a tetraciklinnel szembeni rezisztencia visszaállása alapján. Mivel a töredék EcoRI végét kitöltöttük a Klenow polimeráz I enzimes eljárással, a töredéknek egy .tompa' és egy .tapadós' vége van, ami megfelelő irányítottságot biztosit, ha később egy termelő plazmidba illesztjük a töredéket. Ezután a pTrpl4 termelő plazmidot készítettük elő a fenti HGH-gént tartalmazó töredék befogadására. A pTrphl plazmidot Xbal enzimmel feltártuk, majd a kapott tapadós végeket kitöltöttük a Klenow polimeráz I enzimes eljárással, dATP, dTTP, dGTP és dCTP alkalmazásával. Fenolos és kloroformos extrakeió, végül etanolos kicsapás után a kapott DNS-at BamHI enzimmel kezeltük, és a képződön nagy plazmidtöredéket poliakrilamidgél-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
