196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
20 196457 21-elektroforézissel és elektroelúcióval különítettük el. A pTrpl4 plazmidból nyert töredéknek egy tompa és egy tapadós vége van, ami lehetővé teszi a megfelelő irányítottságú rekombinációt a fentebb ismertetett, HGH- 5 -gént tartalmazó töredékkel. A HGH-gént tartalmazó töredéket és a pTrpl4 aXba-BamHI töredéket hasonló körülmények között kapcsoltuk össze, mint amit fentebb leírtunk. A kitöltött Xbal és EcoRI végek a tompa végek összeillesztésével kapcsolódtak össze, s helyreállt mind az Xbal, mind pedig az EcoRI hely: Xbal (kitöltött)------TCTAG -------AGATC EcoRI (kitöltött) AATTCTATG--------TTAAGATAO--------Ez a szerkezet a tetraciklinnel szemben rezisztens gént is helyreállítja. Mivel a pHGH 107 plazmid tetraciklinnel szembeni rezisztenciát fejez ki a HGH-génen túl elhelyezkedő promotor (lac promoter) hatására, ez a pHGH 207 jelzésű szerkezet tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztositó gén kifejezését teszi lehetővé, amelyet a triptofán promotor-operátor szabályoz. Az összekapcsolt terméket Escherichia coli K-12 294 törzsbe transzformáltuk és 5 ng/ml tetraciklint tartalmazó LB táptalajlemezeken választottuk ki a tenyészeteket. A pHGH 207 plazmidot EcoRI enzimmel feltártuk, s poliakrilamidgél-elektroforézissel, s azt követő elektroelúcióval egy olyan, 300 bázispárból álló töredéket különítettünk el, amely tartalmazza a trp promotort, operátort és a trp vezető riboszóma kötési helyet, hiányzott azonban belőle a lefordítás kiváltásához szükséges ATC szekvencia. Ezt a DNS töredéket a pLelF A plazmid EcoRI helyéhez klónoztuk. A fentebb módosított trp szabályozót (regulon) (Escherichia coli trp operon, amelyből törölve lett a csillapító szekvencia a termelés szintjének szabályozott megnövelése érdekében) tartalmazó termelő plazmidok előre meghatározott menynyiségben szaporíthatok olyan táptalajokon, amelyek a promotoroperátor rendszer elnyomásához elegendő mennyiségű triptofán adalékanyagot tartalmaznak, majd pedig triptofán hiány idézhető elő a pro motor-operátor rendszer elnyomásának megszüntetésére és a kivént kifejezésének biztosítására. Közelebbről, az alábbiak szerint járunk el (itt a 6. ábrára hivatkozunk): 250 ug pL31 plazmidot feltártunk PstI enzimmel, és az 1000 bázispárból álló betétet 6%-os poliakrilamidgélen végzett gélelektroforézissel különítettük el. A gélből elektroelúcióval mintegy 40 ug mennyiségben nyertük ki a töredéket, és három alikvot részre osztottuk a további feltáráshoz: a) A töredék 16 ug mennyiségét részleges feltárásnak vetettük alá 40 egység Bglll enzimmel, 45 percig 37 °C-on, és a reakcióelegyet 6%-os poliakrilamidgélen tisztítottuk. Körülbelül 2 Mg kívánt, 670 bázispárból álló töredéket nyertünk ki. HGH-gén kiváltás ------TCTAGAATTCTATG-------------->------AGATCTTAAGATAC--------, Xbal EcoRI b) Az 1000 bázispárból álló PstI töredék egy másik, 8 Mg mennyiségű részét Avail és Bglll enzimmel kezeltük. A 6. ébrén jelzett, 150 bázispárból álló töredék 1 Mg mennyisé-20 gét gélelektroforézissel nyertük ki. c) Az 1000 bázispárból álló töredék 16 Mg mennyiségét Sau3a és Avail enzimmel kezeltük. 10%-os poliakrilamidgélen végzett elektroforézis után közelítőleg 0,25 Mg 25 (10 pmól) 34 bázispárból álló töredéket kaptunk. A két jelzett dezoxioligonukleotidot: 5’-dAATTCATGTGT (1. számú töredék) és 5’-dGATCACACATG (vagyis 3’-GTACACACTAG, 2. 30 számú töredék) a foszforsavtriészteres módszerrel szintetizáltuk. A 2. számú töredéket a következőképpen foszforileztük: 200 ni (mintegy 40 pmól) (gamma 32P) adenozin-lrifoszfátot (ATP, Arnersham, 35 5000 Ci/mmól) megszárítottunk, és az alábbi összetételű elegyben szuszpendáltunk: 30 ni 60 raM trisz-hidroklorid (pH = 8), 10 mM magnézium-klorid, 15 mM béta-merkapto-etanol, 100 pmól DNS töredék és 2 egység T4 40 polinukleotid kinéz. A reakcióelegyet 15 percig tartottuk 37 °C-on, majd 1 ul 10 mM ATP-ot adtunk hozzá és a reagáltatást további 15 percig folytattuk. Ezután a reakcióelegyet 15 percig melegítettük 70 °C-on, és 45 100 pinól 5’-OH töredékkel (1- számú) és 10 pmól, 34 bázispárból álló, Sau3a és Avail közötti töredékkel kapcsoltuk össze. Az ószszekapcsolást 5 órán át végeztük 4 °C-on a következő összetételű elegyben: 50 ni 20 mM 50 trisz-hidroklorid (pH = 7,5), 10 mM magnézium-klorid, 10 mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP és 10 egység T4 DNS-ligáz. Az összekapcsolás után a reakcióelegyet eiektroforézisnek vetettük alá 6%-os poliakrilamidgélen, és a 45 55 bázispárból álló terméket elektroelúcióval nyertük ki. A 45 bázispárból álló termék 30 ng (1 pmól) mennyiségét 0,5 pg (5 pmól) Avall-Bglll töredékkel (150 bázispárból áll) és 50 1 ng (2 pmól) BglII-PstI töredékkel (670 bázispárból áll) kapcsoltuk össze, 20 °C-on 16 órán át, 20 egység T4 DNS-ligáz alkalmazásával. A ligázt 10 percig 65 °C-on történő hevítéssel inaktiváltuk. A reakcióelegyet ezután 55 EcoRI és PstI enzimmel kezeltük a gén poli-12
