196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
36 196457 37 fibrint és egyéb részecskéket percenkénti 35.000 fordulatszámon 90 percig végzett centrifugálással távolítottuk el. Minden egyes fertőzésátvitelnél az összegyűjtött váladékot megvizsgáltuk a fajlagos antitest-aktivitásra vonatkozólag antitest-megkötő teszttel (Staehelin és munkatársai, idézett publikáció). A kielégítőnek talált váladékokat egyesítettük. Az oldatok fehérjekoncentrációjának meghatározása azon a becslésen alapult, hogy az 1 cm-es küvettában, 280 nm hullámhoszszúságú fényben 1 mg fehérje abszorbanciája 1,2. A hasvízkórnál képződő, nagy antitest-tartalmú váladék 30-35 mg/ml fehérjét tartalmaz. Ez egyenértékű 4-7 mg/ml antitest-koncentrációval. A folyadékot PBS-vel (0,01 M nátrium-foszfát /pH = 7,3/, 0,15 M nátrium-klorid) 10-12 mg/ml fehérjekoncentrációig hígítottuk. 100 ml hígított oldathoz 90 ml mennyiségű, szobahőmérsékleten telített ammónium-szulfát-oldatot adtunk, lassan, erőteljes keverés közben, 0 °C-on. A szuszpenziót 10- 60 percig jég között tartottuk, majd 15 percig 10.000/perc fordulatszámon centrifugáltuk 4 °C-on. A felülúszó folyadékot dekantáltuk és jól leszívtuk. A fehérje szemcséket az I. pufferoldatban oldottuk (0,02 M trisz-hidroklorid /pH = 7,9/, 0,04 M nátrium-klorid). A fehérjeoldatot 16-18 órán át dializáltuk szobahőmérsékleten 100 térfogatrósz 1. pufferoldattal szemben. A dialízis során legalább egyszer kicseréltük a puí'feroldatot. A dializált oldatot 10 percig centrifugáltuk 15.000/perc fordulatszámon a feloldatlan anyag eltávolítása céljából. A hasvizkóros állatok váladékában lévő összes fehérje eredeti mennyiségének mintegy 30-35%-át nyeltük ki a 280 nm hullámhosszúságú fénnyel végzett abszorpciós meghatározás alapján. A 30-40 mg/ml fehérjét tartalmazó oldatot ezután DEAE-cellulózzal töltött oszlopra vittük fel, miután az adszorbenst egyensúlyba hoztuk az I. pufferoldattal. 1-1 g felvitt fehérjéhez legalább 100 ml oszlopágy-térfogatot használtunk. Az antitesteket 0,02 M trisz-hidroklorid-oldattal (pH = 7,9) eluáltuk az oszlopról, miközben a nétrium-klorid-koncentrációt lineáris módon 0,04 M-ról 0,5 M értékre növeltük. A 0,06 M és 0,1 M közötti nátrium-klorid-koncentrációknái összegyűjtött frakciókat egyesítettük, és koncentráltuk azonos térfogatú, szobahőmérsékleten telített ammónium-szulfét-oldattal végzett kicsapással és centrifugálással. A fehérjeszemcséket a II. pufferoldatban (0,2 M nátrium- hidrogén-karbonát /pH-érték körülbeül 8,0/ és 0,3 M nátrium-klorid) oldattuk, majd szobahőmérsékleten dializáltuk a II. pufferoldattal szemben. A dialízis során háromszor cser-éltük ki a pufferoldatot. A dializált oldatokat 15 percig centrifugáltuk 20.000 x g értéken az esetleg jelenlevő oldhatatlan anyag eltávolítása céljából. A fehérjekoncentrációt 20-25 mg/ml értékre állítottuk be a II. pufferoldattal. Immunadszorbensek készítése Affigel-10 gélt (BioRad Laboratories, Richmond, California) zsugorított üvegszürön háromszor mostunk jéghideg izopropanollal, majd ugyancsak háromszor jéghideg desztillált vízzel. A körülbelül 50%-os hideg vizes gélszuszpenziót műanyag centrifugacsövekbe töltöttük és rövid ideig végzett centrifugálással ülepítettük. A felülúszó folyadékot leszívtuk. A gélt összekevertük azonos térfogatú tisztított antitest-oldattal és 5 őrén át tartottuk 4 °C-on mozgatás közben. A gél és az antitestet közötti reakció lejátszódása után a gélt. centrifugáltuk, a III. pufferoldattal (0,1 M nátrium-hidrogén-kar bonét, 0,15 M nátrium-klorid) kétszer mostuk a gélhez nem kötődött antitestek eltávolítása céljából. Az egyesitett mosófolyadékokban végzett fehérjemeghatározás azt mutatta, hogy az antitesteknek több mint 90%-a gélhez kötődött. A gélben jelenlévő . reagálatlan helyek elzárására a gélt a térfogatával megegyező mennyiségű 0,1 M etanolamin-hidroklorid-oldattal (pH = 8) kevertük össze és 60 percig szobahőmérsékleten tartottuk mozgatás közben. A gélszuszpenziót PBS oldattal a reagensektől mentesre mostuk és 4 °C-on PBS oldatban tároltuk, 0,02 vegyes % nátrium-azid jelenlétében. N. Parenterális beadás A ieukocita interferon beadható parenterálisan olyan személyeknek, akiknél daganatellenes vagy vírusellenes kezelésre van szükség, valamint olyan esetekben, amikor immunszupressziv viszonyok állnak fenn. Az alkalmazott dózis ugyanolyan lehet, mint a jelenleg. klinikai vizsgálat alatt álló, emberi eredetű anyagoké, például körülbelül napi (1-10) x 106 egység. Olyan anyagok esetében, amelyek koncentrációja 1% feletti, valószínűleg például 5 x 107 egységig terjedhet a napi dózis. Például a következőképpen állíthatunk elő egy parenterálisan beadható, gyakorlatilag homogén, bakteriális úton termelt leukocita interferon készítményt: 3 mg Ieukocita interferont, amelynek fajlagos aktivitása mondjuk 2 x 10s egység/mg, 25 ml 5%-os humán szérum albuminban oldunk, az oldatot bakteriológiai szűrőn vezetjük át és a szürletet aszeptikus körülmények között 100 ampullába töltjük. Minden egyes ampulla 6 x lO1* egység tiszta interferont tartalmaz, amely parenterálisan beadható. Az ampullákat célszerűen hidegen (-20 °C) tároljuk felhasználás előtt. 5 lC-ló 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 20
