196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
34 196457 35 7. Kationcserélö kromatográfia karboxi-metil-cellulóz segítségével 35 mM ammónium-acetát-oldatban, pH = 5,0 értéken, 0,2 M ammónium-acetét-koncentrációig változtatott grédiens mellett. Ezzel az eljárással 95% feletti tisztaságú anyagot kapunk. Az anyagot egyéb módszerekkel is tisztíthatjuk, így méretkizárásos kromatográfiával, fordított fázisú (RP-8) nagynyomású folyadékkromatográfiával vagy i-ögzitett antiinterferon-antitesteken végzett affinitáskromatogréfiával. Úgy is eljárhatunk, hogy a fenti műveletsor 4. pontja szerint nyert anyagot monoklón antitest-oszlopra visszük fel {Milstein, Scientific American, 243, 66 /1980/), majd 0,2 M ecetsavat, 0,1% Tritont és 0,15 M nátrium-kloridot tartalmazó oldattal eluáljuk. Előnyösen úgy is eljárhatunk, hogy a találmány szerint előállított leukocita interferont az alábbi lépésekkel tisztítjuk: 1. A termelt leukocita interferont tartalmazó, szemcsékké fagyasztott sejteket kézi úton vagy alkalmas őrlőberendezéssel összetörjük. A részben felengedett sejteket 4 térfogatrész .A" pufferoldatban szuszpendáljuk, amelynek összetétele a következő: 0,1 M trisz 17,5-8,0 közötti pH-ra beállítva), 10 vegyes % szacharóz, 0,2 M nátrium-klorid, 5 mM etilén-diamin-tetraecetsav, 0,1 mM PMSF és 10- 100 mM magnézium-klorid. A szuszpenziót 4 °C körüli hőmérsékleten tartjuk. A szuszpenziót homogenizáló berendezésen vezetjük át 41,5 • 106 Pa körüli nyomáson, majd ismét átvezetjük 6,9 • 1ÜC Pa alatti nyomáson. Mindkét átvezetésnél a homogenizáló berendezésből eltávozott folyadékot jeges fürdővel hűtjük. 2. A homogén anyaghoz 0,35% körüli koncentráció eléréséig lassan polietilén-imint adunk és körülbelül 30 percig állni hagyjuk. A szilárd anyagot centrifugáljuk vagy szűrjük. Ennél a lépésnél vagy szabályoznunk kell a hőmérsékletet, vagy elég gyorsan elvégezni a műveletet ahhoz, hogy a felülúszó folyadék (illetve szürlet) hőmérséklete 10 °C alatt maradjon. A felülúszó folyadékot (illetve szűrletet) ultraszüréssel az eredeti térfogatának mintegy 1/10-ére koncentráljuk. A visszamaradt folyadék esetleges zavarossága megfelelő szűrő, például mikropórusú membrán segítségéve szüntethető meg. 3. A tisztított oldatot közvetlenül egy monoklón antitest-oszlopra vezetjük 5-8 cm/ óra fluxus mellett (például 25-40 ml per óra sebességgel 2,6 cm átmérőjű oszlop esetén). Az oszlopra történő felvitel után az oszlopot a térfogata mintegy tízszeresének megfelelő mennyiségű 25 mM trisz-hidroklorid-oldattal (pH = 7,5-8,51 mossuk, amely 0,5 M nátrium-kloridot és felületakti v anyagot (például 0,2% Triton X-100-at vagy vele egyenértékű készítményt) tartalmaz. A mosás után az oszlopot a térfogata mintegy tízszeresének megfelelő mennyiségű oldattal öblítjük át, amely 0,15 M nátrium-kloridot és felületaktív anyagot (például 0,1% Triton X-100-at vagy vele egyenértékű készítményt) tartalmaz. Az oszlopot ezután felületaktív anyagot (például 0,1% Triton X-100-at vagy vele egyenértékű készítményt) tartalmazó 0,2 M ecetsav-oldattal eluáljuk. A fehérje maximumnál a monoklón antitest-oszlopról eltávozó folyadékot elegyítjük, és a pH-értékét körülbelül 4,5-re állítjuk be 1 n nátrium-hidroxid-oldat vagy 1,0 M trisz bázis segítségével (a fehérje maximumot az ultraibolya-abszorbancia alapján vagy más alkalmas vizsgálattal határozzuk meg.) 1. Az interferont tartalmazó oldatot olyan kationcserélő oszlopra (például Whatman CM52 cellulóz vagy’ vele egyenértékű készítmény) visszük fel, amelyet előzetesen egyensúlyba hoztunk alkalmas pufferoldattal, például 50 mM ammónium-acetát-oldattai (i ll = 1,5). Az oszlopot az interferon felvitele után addig mossuk a fenti pufferoldattal, amíg a távozó foly’adék ultraibolya-abszorbanciaja állandó értéket nem ér el. Ezzel biztosítjuk, hogy kevés, az interferontól eltérő fehérje távozzon az oszlopról az elúció során. Az oszlopot ezután 25 mM ammónium-acetátot és 0,12 M nátrium-kloridot tartalmazó oldattal vagy oly’an eluálószer-kombinációval eluáljuk, amellyel optimális módon távolítható el az interferon, és kielégítő megjelenésű és oldhatóságú liofilizált terméket szolgáltat. A fenti tisztító eljárásnál alkalmazott monoklón antitestek Staehelin és munkatársai eljárásával állíthatók elő (Proc. Natl. Acad. Sri. USA, 78, 1848-52 /1981/). A monoklón antitestek tisztítását és Affigel-10 gélhez kovalens kötéssel való kapcsolását az alábbiak szerint végezzük: Monoklón antitestek előállítása hasvízkórnál képződő váladékból és tisztítása Ót nőstény’ Balb/c egeret beoltottunk (5-10) x 10G mennyiségű, közepes növekedési fázisban lévő hy’bridoma sejttel. A váladékot termelő egerekből vett körülbelül 5 x 10G mennyiségű életképes sejttel intraperitoneálisan beoltottunk 10 vagy’ még több egeret. Minden egy’es egértől ismételten (2-4 alkalommal) összeg'y'üjtöttük a hasvizkóros váladékot. Legfeljebb három alkalommal vihető át a fertőzés az egyik egércsoportról a másikra. Egy-egy átvitel előtt az egerektől vett hasvizkóros váladékokat elegy’ítettük. A hasvizkóros váladékból a sejteket és sejttöredékeket 15 percig végzett kissebességű centrifugálással (500-1000 x g) távolítottul; el. Ezután 90 percig centrifugáltuk percenkénti 18.000 fordulatszámon. A felülúszó foyadékot megfag.vasztottuk és -20 °C- on tároltuk. Felengedés után a még jelenlévő 19 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
