196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
32 196457 33 olyan töredéket kaptunk, amely a LelF H 166 aminosavjét kódolja: 1 166 met cys asp megállító ATG TGT.. ...GAT TGA__...___PstI Sau 3a 6. A pLelF A trp 25 plazmidot Xbal enzimmel feltártuk, DNS polimeráz I enzimmel tompavégüvé alakítottuk, majd a terméket PstI enzimmel feltártuk. A kapott nagy töredéket elkülönítettük és összekapcsoltuk a fenti 5. pont szerinti termékkel. Olyan expressziós pLelF H plazmidot kaptunk, amely Escherichia coli K-12 29-1 törzsbe vagy más .gazda' baktériumba transzformálva képes az érett LelF H termelésére. LelF I Az emberi genom A-fág Charon 4A rekombinációs .könyvtár'-át, amelyet Lawn és munkatársai hoztak létre (Cell, 15, 1157 /1978/) szűrővizsgálatnak vetettünk alá a leukocita interferon génekre vonatkozólag a Lawn és munkatársai (idézett irodalmi hely), valamint Maniatis és munkatársai (Cell, 15, 687 /1987/) által leírt módon. Egy, a cDNS LelF A kiónból származó radioaktív LelF mintát használtunk közelítőleg 500.000 vérlemezke szűrővizsgálatához. Ennek során hat LelF genom kiónt kaptunk. Ismételt szűrővizsgálat és vérlemezke-tisztítás után e kiónok egyikét (AHLeIF2) választottuk ki a további elemzéshez. A fentebb ismertetett módszer segítségével más mintákat is alkalmazhatunk további LelF kiónoknak az emberi genomból való elkülönítéséhez. Ezek viszont felhasználhatók további leukocita interferon fehérjéknek a találmány szerinti előállítására. 1. A AHLeIF2 klón 2000 bázispárból álló EcoRI töredékét klónozással bevittük a pBR325 plazmidba az EcoRI helynél. A kapott LelF I plazmidot EcoRI enzimmel hasítottuk és elkülönítettük a 2000 bázispárból álló töredéket. A dAATTCTGCAG dezoxioligonukleotidot (EcoRI-PstI átalakító) hozzákapcsoltuk a 2000 bázispárból álló EcoRI töredékhez, majd a terméket PstI enzimmel hasítottuk. így egy 2000 bázispárból álló, PstI végeket tartalmazó töredéket kaptunk. Ezt Sau96 enzimmel elhasitottuk, és egy 1100 bázispárból álló töredéket különítettünk el, amelynek egy PstI és egy Sau96 vége van. 2. A pLelF C trp 35 plazmidot feltártuk PstI és Xbal enzimmel. A nagy töredéket különítettük el. 3. A pLelF C trp 35 plazmid Xbal és PstI enzimmel végzett feltárásánál képződött kis töredéket Xbal és Sau96 enzimmel feltár- 18 tűk. Egy 40 bázispórból álló, Xbal-Sau96 töredéket különítettünk el. 4. A fenti 1., 2. és 3. pont szerint elkülönített töredékeket összekapcsoltuk, és ilyen módon a pLelF I trp 1 termelő plazmidot kaptuk. LelF J 1. Az emberi genom A-fág Charon 4A rekombinációs könyvtárából kiindulva az előző szakaszban leírthoz hasonló módon nyerhető pLelF J plazmid a humán genom-DNS 3,8 kilobázisú, a LelF J génszekvencia HindlII töredékét tartalmazza. Ebből a plazmidból egy 760 bázispárból álló Ddel-Rsal töredéket különítettünk el. 2. A pLelF B trp 7 plazmidot HindlII és Ddel enzimekkel elhasítottuk. Egy 340 bázispárból álló HindlII-Ddel töredéket különítettünk el. 3. A pBR322 plazmidot PstI enzimmel elhasitottuk, DNS polimeráz I (Klenow töredék) enzimmel inkubálva tompa-végűvé alakítottuk, és HindlII enzimmel feltáruk. A nagy (körülbelül 3600 bázispárból álló) töredéket különítettük el. 4. A fenti 1., 2. és 3. pont szerint elkülönített töredékeket összekapcsoltuk egymással. így a pLelF J trp 1 termelő plazmidot kaptuk. M. Tisztítás A baktériumtenyészetek extraktumainak leukocita interferon tartalmát (és ezzel együtt az interferon tisztaságát) az alábbi, egymást követő műveletekkel növelhetjük: 1. Kicsapás polietilén-iminnel, amelynek során a sejtfehérje legnagyobb része, az interferonnal együtt, a felülúszó folyadékban marad. 2. Frakcionálás ammónium-szulfáttal, amikor az interferon az oldatból átkerül az 55%-os telitett ammónium-szulfátba. 3. Az ammónium-szulfát szemcséket 0,06 M kálium-foszfát és 10 mM trisz-hidroklorid (pH = 7,2) elegyében szuszpendáljuk, és 25 mM trisz-hidroklorid (pH = 7,9) oldattal szemben dializáljuk (az interferon aktivitás oldatban marad). 4. A fenti felülúszó folyadék pH-értékét 8,5-re állítjuk be és DEAE-cellulóz töltetű oszlopon kromatografaljuk. Az elúciót 25 mM trisz-hidroklorid-oldattal (pH = 8,5) végezzük, zérusról 0,2 M nátrium-klorid-koncentracióra növelt lineáris grádiens mellett. 5. Adszorpciós Cibachrome Blue-Agarose vagy hidroxil-apatit adszorbensen és elúció 1,5 M kálium-klorid-oldattal illetve 0,2 M foszfát-oldattal (fakultativ). 6. Molekulaméret alapján történő elválasztás SephadexlH) G-75 oszlopon. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
