196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
30 196457 31 tűk és elkülönítettük a körülbelül 335 bázispárból álló terméket. (2) A fenti (1), (b) és (d) pont szerinti három terméket összekapcsoltuk, és a kapott plazmiddal Escherichia coli K-12 294 lörzset transzformáltunk. Az így nyert jellemző klón az Escherichia coli K-12 294/pLeIF C trp 35. LelF D Elkülönítettük az alábbi töredékeket a pLelF D plazmidból: (a) 35 bázispár hosszúságú, Sau3a és Avail közötti rész, (b) 150 bázispár hosszúságú, Avail és Bglll közötti rész, (c) közelítőleg 700 bázispár hosszúságú, Bglll és PstI közötti rész. Elkülönítettük a pLelF A trp 25 plazmidból az alábbi töredékeket: (d) 300 bázispár hosszúságú, HindlII és Sau3a közötti rész. Elkülönítettük a pBR322 plazmidból az alábbi töredéket: (e) közelítőleg 3600 bázispár hosszúságú, HindlII és Pstl közötti rész. Előállítás: (1) Összekapcsoltuk a fenti a) és b) pont szerinti töredéket, a terméket Bglll enzimmel elhasítottuk és a kapott, 185 bázispárból álló terméket tisztítottuk. (2) Összekapcsoltuk a fenti (1) és d) pont szerinti terméket, az összekapcsolási terméket HindlII és Bglll enzimmel hasítottuk. Tisztítás után közelitőleg 500 bázispárból álló terméket kaptunk. (3) A fenti (2) pont szerinti terméket összekapcsoltuk a c) és e) pont szerinti töredékkel, és a kapott plazmiddal Escherichia coli K-12 294 törzset transzformáltunk. Az így nyert jellemző klón az Escherichia coli K-12 294/pLeIF D trp 11. LelF F A LelF F-tartalmú töredéket annak alapján állíthatjuk elő, hogy a LelF B és a LelF F 1-13. számú aminosavjai teljesen homológok. A fentebb leirt pHGH 207 plazmidból megfelelő konfigurációjú végekkel rendelkező trp promotort tartalmazó töredéket (a) állítottunk elő Pstl és Xbal enzimmel végzett feltárás és a körülbelül 1050 bázispárból álló töredék elkülönítése útján. Egy második töredéknek (b) a pHKY*T0 vagy pBR 322 (ATCC 31344) plazmid Pstl és Bglll enzimekkel végzett feltárásénál képződő töredékei; közül a nagyobbikat vettük. Az (a) töredék tartalmazza az ampicillinnel szembeni rezisztenciát kódoló génnek mintegy felét, a (b) töredék pedig e gén hátralévő részét tartalmazza, továbbá a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát kódoló gént, a promotor kivételével. Az (a) és (b) töredéket T4 ligázzal öszszekapcsoltuk, a terméket Xbal és Bglll enzimmel kezeltük a dimerizéció kiküszöbölésére. Ekkor a (c) töredéket kaptuk, amely a trp promotor-operétor rendszert, valamint a tetraciklinnel és ampicillinnel szembeni rezisztenciát kódoló géneket tartalmazza. A pLelF F plazmid Avail és Bglll enzimekkel végzett feltárásával egy közelitőleg 580 bézispárból álló (d) töredékhez jutottunk. Ez a LelF F 14-166. számú aminosavjaira vonatkozó kodonokat tartalmazza. A pLelF B plazmid Xbal és. Avail enzimekkel végzett feltárásával az (e) töredéket kaptuk, amely 49 bázispárból áll. Az (e) töredék a LelF F 1-13. számú aminosavját kódolja. A (c), (dl és le) töredéket egymáshoz kapcsoltuk T4 ligáz jelenlétében. Az illető töredékek kohéziós végei olyanok voltak, hogy a felépített plazmid megfelelően köralakú lett, és igy a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát kódoló gén az érett LelF F-re vonatkozó génnel együtt a trp promotor-operétor rendszer irányítása alá került. Ennek következtében a kivént plazmiddal transzfox-mált baktériumokat tetraciklin-tartalmú táptalajlemezekeri lehetett kiválogatni. Égy ily módon nyert, jellemző klón az Escherichia coli K-12 294/pLeIF F trp 1. LelF H Az érett leukocita interferon kifejezéséhez szükséges teljes LelF H gént a következőképpen állítottuk elő: 1. A pLelF H plazmidot Haell és Rsal enzimmel feltártuk, és egy 816 bázispárból álló töredéket különítettünk el, amely a 10. számú jel peptid aminosavtól a 3’ nem-kódoló tartományig terjed. 2. A töredéket denaturáltuk és a DNS poiimeréz 1 Klenow töredékével kezelve (Klenow és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 65, 168 /1970/) bézispérosító szintézist végeztünk az 5’-dATG TGT AAT CTG TCT szintetikus dezoxiribooligonukleotid alaprész alkalmazásával. 3. A kapott terméket Sau3a enzimmel hasítottuk és eg'y 452 bézispárból álló töredéket különítettünk el. Ez a töredék az 1- 150. számú aminosavaknak felel meg. 1. A pLelF H plazmidot Sau3a és Pstl enzimmel feltártuk és égy 500 bézispárból álló töredéket különítettünk el. Ily módon olyan gént kaptunk, amely a 150. számú aminosav és a kódoló szekvencia vége közötti aminosavakat kódolja. 5. A fenti 3. és 4. pont szerint elkülönítet. töredékeket összekapcsoltuk, és igy egy 17 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
