196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
28 196457 29 4. A pLelF A trp 25 plazmidból egy közelítőleg 300 bázispárból álló töredéket (HindlII és Sau3a közötti rész) különítettünk el, amely tartalmazta a LelF A trp promotor-operátor rendszerét, riboszóma kötési helyét, ATG beinditójelét és cisztein kodonját. 5. A pBR322 plazmidból egy közelítőleg 3600 bázispárból álló, a .Pstl és HindlII közötti töredéket különítettünk el. Ez tartalmazta a replikont és kódolta a teti-aciklinnel szembeni rezisztenciát, nem kódolta azonban az ampicillinnel szembeni rezisztenciát. 6. A 3., 4. és 5. pont szerinti lépésekben kapott töredékeket összekapcsoltuk, és a kapott plazmidot Escherichia coli K-12 294 törzsbe transzformáltuk. A tx-anszformált termékeket megvizsgáltuk (Bimbóim és munkatársai, Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523 /1979/1, és a plazmid mintákat EcoRI enzimmel feltártuk. A feltárás három töredéket szolgáltatott, amelyek a következőkre jellemzők: 1.) EcoRI - EcoRI trp promotor töredék; 2) a PL4 klón belső EcoRI - EcoRI töredéke; és 3) a pL4 klón EcoRI töredékéig terjedő, fehérjelefordítást kiváltó startjel. A CPE vizsgálat azt az eredményt adta, hogy a fenti módon nyert kiónok bakteriális extrák tu mai ban az interferonaktivitás 10 x 106 egység/liter volt, Asso = 1 értéknél. Egy ily módon előállított jellemző klón az Escherichia coli K-12 294/pLeIF B trp 7. L. További érett leukocita interferonok (LelF C, D, F, H, I és J1 közvetlen expressziója Más LelF típusokat tartalmazó további, teljes hosszúságú géntöredékek állithatók össze és vihetők be termelő közegekbe, ugyanúgy, mint a LelF A esetén. Az ismert módon történő szekvenciameghatározás feltárja, hogy egy restrikciós hely elég közel fekszik-e az érett interferontípus első aminosav kodonjához, hogy ezáltal lehetővé tegye a fenti H. pontban ismertetett módszer alkalmazását, azaz az elószekvencia eltávolítását restrikciós hasítással, és az ennek során eltávozott, a N-terminális aminosavakra vonatkozó kodonok pótlását szintetikus DNS töredékkel való összekapcsolással. Ha ez nem lehetséges, a következő eljárás. alkalmazható: Az előszekvenciát tartalmazó töredéket pontosan azon a helyen hasítjuk el, ahol az érett polipeptid első aminosavjára vonatkozó kodon kezdődik, úgy, hogy 1. a kétszálú DNS-at egyszálú DNS-vá alakítjuk az illető helyet körülvevő tartományban; 2. az egyszálúvá alakított tartományhoz egy kiegészítő alaprészt hibridizálunk az egyszálú DNS-ból, úgy, hogy az alaprész 5' vége a tervezett hasítási hely melletti nuk- 16 leotiddal szemközt helyezkedjen el; 3. az 1. pont szerinti művelet során a második szálból eltávolított részt helyreállítjuk. Ez az alaprészhez képest a 3’ irányban helyezkedik el. A helyreállítást DNS-polimerázzal végezzük, adenint, timint, guanint és citozint tartalmazó dezoxinukleotid-trifoszfátok jelenlétében; és 4. a DNS megmaradt egyszálú részét - amely túlnyúlik a tervezett hasítási ponton - feltárjuk. A kódoló szál 3’ végénél végződő, rövid, szintetikus DNS, amely tartalmazza a lefordítást kiváltó ATG jelet, hozzákapcsolható például tompa végződésen keresztül az érett interferonokra vonatkozó, kapott génhez, a gén pedig termelő plazmidba illeszthető és egy promotor és az azzal kapcsolatos riboszóma kötési hely irányítása alá vihető. Hasonló módon, mint ahogy a fenti K. részben ismertettük, előállítottunk a LelF C-t és a LelF D-t kódoló géntöredékeket az említett interferontípusok közvetlen, bakteriális úton történő termeléséhez. Ezeknek a leukocita interferonoknak az előállítása minden esetben egy közelitöleg 300 bázispárból álló töredéken alapult (HindlII és Sau3a közötti rész), amely a trp promotor-operátor rendszert, a riboszóma kötési helyet, az ATC beindító jelet és a LelF A interferonnak a pLelF A trp 25 plazmidtól származó cisztein kodonját tartalmazza. Ehhez a többi interferon génből nyert géntöredékeket kapcsoltunk, amelyek az egyes amínosav-szekvenciákat kódolták a kezdeti cisztein után, amely mindegyikben megtalálható. Az egyes kapott plazmidokat felhasználtuk az Escherichia coli K-12 294 törzs transzformálásához. Az illető gének kialakítását célzó összekapcsolásokat a következőképpen végeztük: LelF C Elkülönítettük az alábbi töredékeket a pLelF C pazmidból: (a) 35 bázispár hosszúságú, Sau3a és Sau96 közötti rész, (b) több mint 900 bázispár hosszúságú, Sau96 és Pstl közötti rész, (c) elkülönítettünk egy közelítőleg 300 bázispárból álló töredéket (HindlII és Sau3a közötti rész) a pLelF A trp 25 plazmidból a fenti K. (4) részben leírtak szerint, (d) elkülönítettük a fenti K. 15) rész szerinti, közelítőleg 3600 bázispárból álló töredéket. Előállítás: (1)A fenti (a) és (c) pont szerinti töredéket összekapcsoltuk, majd a kapcsolási terméket BglII és HindlII enzimmel hasítot-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
