196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
26 196457 27 dése volt megfigyelhető körülbelül 8 órával a halál beállta előtt. Az interferonnal kezelt állatoknál nem tapasztaltuk ezeket a tüneteket. Végig tevékenyek voltai, virémia nem alakult ki. Az az egyetlen majom a kontroll csoportban, amelynél nem fejlődött ki virémia 4 nap elteltével, a legkésőbb pusztult el 1164 órával a fertőzés után), s a tetemnél nagy virustitert mértünk a szívben és az agyban. Az interferonnal kezelt majmokban nem fejlődtek antitestek az EMC vírussal szemben, amint azt a fertőzés utáni 14. és 21. napon végzett meghatározásoknál tapasztaltuk. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a leukocita interferon készítmények vírusellenes hatása a megfertőzött állatokban egyedül az interferonnak tulajdonítható, mivel a szennyező fehérjék egészen különbözőek a bakteriális eredetű és a standard készítményeknél. A kapott eredmények azt is jelzik, hogy a glikozil-csoportok jelenléte nem szükséges a LelF A in vivo vírusellenes aktivitásához. J. A kiegészítő dezoxiribonukleinsavak elkülönítése további leukocita interferonokhoz A teljesen jellemzett LelF A cDNS-tartalmú plazmidból DNS-at hasítottunk ki Pstl enzimmel, poliak r ilamid gél-elek troforézissel elkülönítettük és 32P izotóppal megjelöltük. A kapott, radioaktív izotóppal jelzett DNS-at felhasználtuk az Escherichia coli K-12 294 törzzsel nyert további Lranszformánsok vizsgálatához. E transzformánsokat az F. pontban leírt módon állítottuk elő, Grunstein és Hogness in situ tenyészetvizsgaló eljárásával (lásd fentebb). Azokat a telepeket különítettük el, amelyek az izotóppal jelzett mintával különböző mértékben hibridizáiódtak. Ezekből a tenyészetekből és a G. pontban említett tiz hibridizáló tenyészetből a plazmid DNS-at Pstl enzimmel történő hasítással különítettük el és három különböző módszerrel jellemeztük: Először, ezeket a Pst töredékeket a restrikciós endonukleáz enzimekkel (Bglli, PvuII és EcoRI) való feltárási jellemzőkkel vizsgáltuk. Ez az analízis legalább nyolc különféle típusra való felbontást tett lehetővé (LelF A, LelF B, LelF C, LelF D, LelF E, LelF F, LelF G és LelF Hl, amint az az 5. ábrán látható. Ezzel megközelítettük a különböző restrikciós hasításoknak a jelenleg ismert LelF A előszekvenciához és kódoló szekvenciához viszonyított elhelyezkedését. Úgy véljük, hogy az egyik típus, a LelF D azonos azzal, amelyről Nagata és munkatársai (Nature, 284, 316-320 /1980/) beszámolnak. Másodszor, bizonyos dezoxiribonukleinsavakat a Cleveland és munkatársai által leírt (Cell, 20, 95-105 /1980/) hibridizációs kiválasztási teszttel vizsgáltuk. Ennél a tesztnél azt a képességet nézzük, amely biztosítja a LelF mRNS szelektív eltávolítását a poli(Al-tartalmú KG-1 sejt ribonukleinsavjából. Harmadszor, az utóbbi Pst töredékeket beillesztettük egy termelő plazmidba, Escherichia coli K-12 294 törzset transzformáltunk a plazmiddal és a törzs a töredékeket termelte. A kapott termékek - feltehetően elö-interferonok - mindegyike mutatott interferonaktivitást a CPE teszt során, bár a LelF F töredék esetében az aktivitás csekély mértékűnek bizonyult. A fentiekben túlmenően valamennyi fentebb ismertetett LelF típus szekvenciáit is meg határoztu k. K. Egy második érett leukocita interferon (LelF B) közvetlen expressziója Az érett LelF B-hez szükséges gént tartalmazó elkülönített töredék szekvenciája azt mutatja, hogy a LelF A és LelF B első 14 nukleotidja azonos. Ennek megfelelően elkülönítettük a pLelF A trp 25 plazmidból egy olyan töredéket, amely tartalmazza a trp proraotor-operátor rendszert, a riboszóma kötési helyet és a LelF A (= B) gén kezdetét és összekapcsoltuk a B szekvencia további részével egy termelő plazmidban. A pL4 klón Pst hasítási töredékére és a pLelF A 25 promotorra vonatkozó restrikciós térkép a 7a. illetve 7b. ábrán látható. (A pL4 a LelF B Pst-végződésű, az 5. ábrán vázolt génjét tartalmazza.) Ahhoz, hogy megkapjuk a közelítőleg 950 bázispárból álló, Sau3a és Pstl közötti töredéket a 7a. ábrán bemutatott szekvenciából, különböző lépésekre volt szükség egy vagy több zavaró Sau3a restrikciós hely jelenléte miatt: 1. Az alábbi töredékeket különítettük el: a) Sau3a és EcoRI közötti, 110 bázispárból álló töredék, b) EcoRI és Xba közötti, 132 bázispárból álló töredék, c) Xba és Pst közötti, 700-nál több bázispárból álló töredék. 2. A fenti la) és 1 b) töredéket összekapcsoltuk és Xba és Bglli enzimmel szétvágtuk, hogy elejét vegyük a Sau3a és Xba végződéseken keresztüli önpolimerizációnak (a Sau3a hely a Bglli helyen belül volt, a Bglli hasításnál tapadós Sau3a végződés maradt vissza). Egy 242 bázispárból álló töredéket különítettünk el. 3. A fenti 2. pont és az le) pont szerinti terméket összekapcsoltuk és szétvágtuk Pstl és Bglli enzimekkel, az önpolimerizáció megakadályozására. Egy közelítőleg 950 bázispárból álló töredéket különítettük el, amely a 7a. ábrán látható Sau3a és Pstl közötti résznek felel meg. Ez a töredék tartalmazta a LelF B génnek azt a részét, amely nem közös a LelF A génnel. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
