196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
24 196457 25 2. táblázat pLelF A trp 25 plazmidot tartalmazó Escherichia coli K-12 294 törzs extraktuma aktivitásának összehasonlítása a standard leukocita interferon aktivitásával“ Interferonaktivités, egység/ml Kezeletlen pH = 2 Nyúl antihunián leukocita antitestek pLelF A trp 25 plazmidot tartalmazó Escherichia coli K-12 294 törzs extraktuma 500 500 < 10 Standard LelF 500 500 < 10 * A pLelF A trp 25 plazmidot tartalmazó Escherichia coli K-12 294 törzs 250.000 egység/ml fajlagos aktivitású, az 1. táblázatban szereplő extraktumát esszenciális táptalajjal 500-szorosra hígítottuk, hogy a fajlagos aktivitása 500 egység/ml legyen. Egy standard leukocita interferont (Wadley Institute), amelynek aktivitását előzetesen titrálással meghatároztuk a NIH standard leukocita interferonhoz képest, szintén 500 egység/ml végső fajlagos aktivitásra állítottunk be. 1- -1 ml alikvot részeket 1 N sósavval pH = 2 értékig savanyítottunk, 4 °C-on 52 órán ét inkubáltunk, nátrium-hidroxid hozzáadásával semlegesítettünk, és meghatároztuk az inter- 20 feronaklivitást a hagyományos CPE gátlási vizsgálattal. Az 500 egység/ml fajlagos aktivitású (kezeletlen) minták 25 ul térfogatú alikvot részeit 60 percig inkubáltuk 25 ul nyúl antihumán leukocita interferonnal 25 37 °C-on, majd 5 percig centrifugáltuk 12000 g értéken, és a felülúszó folyadékot megvizsgáltuk. 3. táblázat Különféle LelF készítmények vírusellenes hatása selyemmajmok EMC vírusfertőzésére Szérum vérlemezke képződés, egység/ml Kezelés Túlélők 2. nap 3. nap 4. nap Kontroll 0/3 101 3 x 104] 105] (baktériumfehérjék) 0 3 T O o 1200 . oj 0 J 0 J Bakteriális eredetű LelF A 3/3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Standard LelF 3/3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 >3,4 x 104 Az összes majom him volt (átlagos test- 50 súly 713 g), és a fertőzés előtt nem rendelkeztek EMC virus-antitestekkel. A majmokat intrarauszkulárisan fertőztük meg az EMC virus LDso-értékének százszoros mennyiségével (az IDso-érték meghatározása egéren tör- 55 tént). A kontroll csoportba tartozó, megfertőzött majmok 134, 158 illetve 161 órával a fertőzés után elpusztultak. Az interferonos kezelések - 10G egységgel - intravénás beadással történtek a fertőzés előtt 4 órával, 60 illetve utána 2, 23, 29, 48, 72, 168 és 240 órával. A bakteriális eredetű leukocita interferon a pLelF A trp 25 plazmidot tartalmazó Escherichia coli K-12 294 törzs elbontott extraktumának oszlopkromatográfiéval el- 65 különített frakciója volt, s 7,4 x 106 egység/mg fehérje aktivitással rendelkezett. A kontrollként alkalmazott bakteriális fehérjék a pBR322 plazmidot tartalmazó Escherichia coli K-12 294 törzs elbontott extraktumának megfelelő oszlopkromatográfiás frakciójából származtak, a teljes fehérjekoncentráció kétszerese mellett. A standard leukocita interferon normális emberi fehérvérsejtekből Sendai vírussal kiváltott interferon volt, amelyet kromatográfiás úton 32 x 10c egység per mg fehérje fajlagos aktivitás eléréséig tisztítottuk. A kontroll csoportba tartozó állatoknál egyre erősebb levertség, egyensúlyvesztés, a hátsó lábak bénultsága és a szemek vizese14
