196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
22 196457 23 merjei eltávolítása céljából, majd 6%-os poliakrilamidgéllel végzett elektroforézissel tisztítottuk. Mintegy 20 ng (0,04 pinól) mennyiségű, 865 bázispárból álló terméket különítettünk el. Ennek felét (10 ng) 0,3 jug 5 pBR322 plazmidba kapcsoltuk, az EcoRI és PstI részek közé, majd a terméket Escherichia coli K-12 294 törzsbe transzformáltuk. A transzformációval 70 transzformánst kaptunk, amelyek tetracikiinre rezisztensek, ampicil- 10 linre érzékenyek voltak. Közülük 18 transzformánsból elkülönített plazmid DNS-at EcoRI és PstI enzimmel feltártunk. A 18 plazmid közül 16 esetben az EcoRI-PstI töredék 865 bázispár hosszúságú volt. Az egyikből (pLelF 15 Al) 1 pg mennyiséget EcoRI enzimmel feltártunk és 0,1 ug, 300 bázispárból álló EcoRI töredékhez kapcsoltunk. Ez utóbbi töredék az Escherichia coli trp promotort és trp vezető riboszóma kötési helyet tartalmazta, s a 20 fentebb ismertetett módon lett előállítva. A trp promotort tartalmazó transzformált termékeket 32P izotóppal jelzett trp minta és a Grunstein-Hogness-féle telepvizsgáló eljárás alkalmazásával azonosítottuk. A trp töredék- 25 ben aszimmetrikusan elhelyezkedő Xbal hely lehetővé tette azoknak a rekombinált termékeknek a meghatározását, amelyekben a trp promotort a LelF A génnek megfelelően volt irányítva. 30 I. .4 LelF A in vitro és in vivo aktivitása A következőképpen készítettünk extrák- 35 tumokat interferon-vizsgálathoz: A H. szakaszban leirt módon kapott transzformáns 1-1 ml tenyészetét szaporítottunk húsleves táptalajon, amely 5 pg/ml tetraciklint tartalmazott. A szaporítást 1,0 40 körüli Asso-értékig végeztük, majd 5 ug/ml tetraciklint tartalmazó 25 ml M9 táptalajjal hígítottuk. Amikor az A550 értéke 1,0 lett, 10-10 ml mintát különítettünk el centrifugálással. A sejt szemcséket 1 ml 15%-os szacha- 45 róz-oldatban szuszpendáltuk, amely 50 mM trisz-hidrokloridot (pH = 8,0) és 50 mM etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmazott. 1 mg lizozimot adtunk hozzá, 5 percig tartottuk 0 °C-on, majd a sejteket ultrahanggal történő kezeléssel szétválasztottuk. A mintákat 10 percig centrifugáltuk 15000/perc fordulatszámon, és a felülúszó folyadék interferonaktivitásót standard LelF mintákéval összehasonlítva határoztuk meg a citopatikus hatás (CPE) gátlásának vizsgálata alapján. A sejtenkénti interferonmolekulák számának meghatározásához 4 x 10s egység/mg fajlagos aktivitású leukocita interferont használtunk. Amint az az 1. táblázatban látható, a pLelF A trp 25 plazmid - amelyben a trp promotort a kívánt irányítottsággal illesztettük be - nagy aktivitást mutat (2,5 x 108 eg/ség per liter). A 2. táblázatból az tűnik ki, hogy a pLelF A trp 25 promotort tartalmazó Escherichia coli K-12 294 törzs által termelt interferon autentikus emberi leukocita interferonként viselkedik; ellenáll a pH = 2 értéken történő kezelésnek, és semlegesítik a nyúl antihumán leukocita antitestek. Az interferon látszólagos molekulasúlya közelítőleg 20.000. Az interferon in vivo hatékonyságához makrofág és természetes ölő sejtek (NK) jelenlétére van szükség, és úgy tűnik, hogy az in vivo hatásmódhoz hozzátartozik ezeknek a sejteknek a stimulálása. Ezért fennáll annak lehetősége, hogy a pLelF A trp 25 promotort tartalmazó Escherichia coli 294 törzs által termelt interferon - jóllehet vírusölő aktivitással rendelkezik a sejttenyészetben végzett vizsgálatnál - esetleg nem hatékony a vírussal fertőzött állatokban. Emellett a bakteriális úton termelt, glikozil-csoportokat nem tartalmazó LelF A vírusölő aktivitása eltérő lehet az emberi fehérvérsejt eredetű, glikozilezett leukocita interferonétól. Ezért, a bakteriális úton szintetizált LelF 12%-os tisztaságú) biológiai aktivitását összehasonlítottuk a fehérvérsejtekből kinyert LeiF (8%-os tisztaságú) selyemmajom halálos enkefalo-miokarditisz (EMC) vírusfertőzésére gyakorolt hatásával (3. táblázat). 1. táblázat Escherichia coli extrák tu mok ban mért interferon-aktivitás Escherichia Sejtsürüség, Interferoncoli K-12 294 sejt/ml aktivitás, törzs, amelyet egység/ml az alábbi plaztenyészet middal transzformáltunk LelF molekula per sejt pLelF A trp 25 3,5 x 108 36000 9000 pLelF A trp 25 1,8 x 10s 250000 12000 13
