196456. lajstromszámú szabadalom • Eljárás permanens állati és humán sejtvonalak előállítására
12 196456 13 Mich. USA), EAZ Ehrlich-ascites sejtek (ATCC; CCL 77). I. példa: A. Karioplasztok és citoplasztok előállítása a P3X63 Ag 8.653 ATCC-CRL-1580 egér-mileóraasejtvonalból a Wigler, M. H. and 10 Weinstein, I. B.: A Preparative Method for Obtaining Enucleated Mammalian Cells. Biochem* Biophys. Res. Comm. 63, 669-674 (1975)-ben leírt módszerhez hasonlóan. 15 A.l. Anyagok Citoochalasin B-t (CB, Aldrich Biochemicals, Milwaukee, USA) oldunk 2 mg/ml töménységben dimetil-szulfoxidban (DMSO, Merck), és törzsoldatként 4 °C- 20 -on tároljuk. Ficoll-400-at (Pharmacia; polimer nádcukor) oldunk 1 g/ml töménységben redesztillált vízben, autoklávozzuk, és 50%-os törzsoldatként -20 °C-on tároljuk. Egyszeres és két- 25 szeres töménységű Dulbecco-féle minimum esszenciális táptalaj (DMEM), borjú magzatszérum (FKS), L-glutamin (200 mmól/liter), Streptomicin-penicillin a Boehringer Mannheim cégtől. 50 A cellulóz-nitrát csövecskéket ultraibolya-besugárzással sterilezzük. Ag 8.653 ATCC CRL-1580 mielómasejtvonal: A vonalat Kearney, J. F. és mtsai a J. Immunoi. 123, 1548-1550 (1979)-ben 35 írják le. (A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody secreting hybrid cell lines). Ez azaguanin-rezisztens, HAT-szenzitiv, és sem 40 H- sem L-Ig-láncokat nem szintetizál. Tartása DMEM + 15% FKS + glutamin + + penicillin-sztreptomicin + piruvát = = DMEM teljes táptalajban 37 °C-on 7%os szén-dioxid atmoszférában. 45 A.2. Módszerek. Enukleálás: 8 x 107 Ag 8.653 sejtet 5 percig 103 ford/perc-nél centrifugálunk, és 12 ml 12,5%-os Ficoll-DMEM-CB-DMSO oldatban addig szuszpendálunk, amig 50 setjcsomómentes szuszpenziót kapunk. 3-3 ml sejtszuszpenziót rétegezőnk 4-12 órával előbb preparált Ficoll-gradiensre, és 2 ml Ficoll-mentes DMEM-DB-DMSO oldatot rétegezőnk fölé. A gradienssel 55 töltött csövecskéket ultracentrifugában 60 percig 25.000 ford/perc-nél (31 °C) centrifugáljuk. A centrifugálás befejezése után a makroszkopikusan látható frakciókat (.sá- 60 vök") hosszú tűvel ellátott injekciós fecskendő segítségével fentről lefelé összegyűjtjük, 20-20 ml tápoldattal (DMEM adalékok nélkül) hígítjuk, centrifugálással ülepítjük, és friss DMEM-ben újra szuszpendáljuk. A következő 4 frakciót kapjuk: a) sejttörmelék (a 0 és 12,5% Ficoll közötti határon), b) magnélküli citoplasztok 15-16% Ficoll tartományban, c) felismerhető plazmahártya nélküli magok és körülbelül 2% magnélküli .sejt' a 17 és 25% Ficoll közötti határon, d) magot tartalmazó, morfológiai ismérvek szerint intakt sejtek jól felismerhető plazmaburokkal és kevés mag plazmaburok nélkül üledékként a csőfenéken. A sejtszámlálás azt eredményezte, hogy a 8 x 107 Ag 8.653 sejtből a b) frakció 1,25 x 106 citoplasztot, a c) frakció 4 x x 106 karioplasztot és a dl frakció 1,1 x x 107 feltehetően intakt sejtet tartalmazott. B. Egér-lépsejtek fúziója az A pontban elkülönített mielóma-karioplasztokkal, -citoplasztokkal és -üledéksejtekkel. B.l Anyagok Fúzionálószer: 20 g polietilénglikolt (PEG-4000) autoklávban megolvasztunk, 56 °C-ra hütjük, és ezen a hőmérsékleten 20 ml DMEM-mel elegyítjük. HAT-szelekciós táptalaj: DMEM teljes táptalajhoz 4 x 10~7 mól amino-pterint, 1 x lO-4 mól timidint és 3,1 x 10'5 mól hipoxantint adunk. Tenyészedények: A Costar-cég (Cambridge, Mass., USA) 24- és 96-os sejttenyészet csepplemezei. B.2. Módszerek. Fúziók: Az A. pontban előállított b), c) és d) frakciókat elkülönített részletekben 10 : 1 arányban keverjük lépsejtekkel, és eentrifugálással ülepítjük. A felülúszó folyadékot gondosan eltávolítjuk. Az üledékhez 0,8 ml 50%-os PEG-oldatot (37 °C-on körülbelül 1 percig állandó enyhe rázóssal keverjük) és utána 5 ml DMEM-et (szobahőmérsékleten körülbelül 5 percig) adunk. További 20 ml DMEM hozzáadása után a sejteket ülepítjük, 5 ml friss DMEM teljes táptalajban újra szuszpendáljuk, "és 10 .falósejtekkel' fedett 24-es Costar-féle csepp-szövettenyészet edénybe szétosztjuk. Az egyes tenyészeteket az 1., 2., 3., 5., 7., 10., 13 napon DMEM-teljes táptalajjal .tápláljuk'. Falósejtek (feedercells; hasüreg-makrofágok): A fúzió előtti napon Balb/c beltenyésztett egereket kinyújtóssal leölünk. Steril körülmények között 4-5 ml PBS-t fecskendezünk a hasürgbe, és 1 perccel később ismét leszívjuk. A kiöblített sejteket DMEM-ben mossuk, teljes táptalajban 2 x 105 sejt/ml sűrűségre szuszpendáljuk, és 0,5 ml-es adagokban 24-es Cos- Lai—féle csopp-edényekbe osztjuk szét. 8
