196456. lajstromszámú szabadalom • Eljárás permanens állati és humán sejtvonalak előállítására
14 196456 15 Lépsejtek: Egy Balb/c egérnek közvetlenül a fúzió előtt aszeptikus körülmények között eltávolítjuk a lépét, és ennek sejtjeit DMEM-ben szuszpendáljuk. A sejtcsomókat és szövetdarabokat mullgézzel kiszűrjük. Elisa teszt egér-immunoglobulínra: Mikrotiterlemezekre júhból nyert egér-Ig-antitesteket (IgG-frakció; 10 Mg/ml 0,9%-os nétrium-klorid oldat; 150 pl antitest-oldat cseppüregenként) rétegezünk. A cseppüregekbe 100-100 pl tenyészetfelülúszót pipettázunk, és szobahőmérsékleten egy órán keresztül inkubáljuk. A felülúszók leszívása és kétszeri mosása után a cseppüregekbe 100 pl anti-egér-Ig-POD-konjugótum oldatot (azonos antitestek, mint fenn; torma-peroxidázhoz kovalensen kötve) teszünk, és szobahőmérsékleten egy óra hosszáig inkubáljuk. Háromszori mosás után cseppüregenként 100 pl szubsztrát-oldatot (ABTS) pipettázunk hozzá, és az elszíneződést fotometriásan mérjük. B.3. Eredmények. Az A pont szerint készített citoplaszt-, karioplaszt- és üledék-frakciókat párhuzamosan Balb/c egér lépsejtjeivel fuzionáljuk, és 10-10 1 ml-es tenyészetre osztjuk szét. A résztenyészetek 5-5 miét HAT-adalék nélkül (1. lemez) és 5-5 ml-ét HAT-adalékkal (II. lemez) tápláljuk. A fúzió utáni 21. napig a cseppüregek egyikében sem volt észlelhető limfoid sejtek növekedése makroszkopikusan vagy mikroszkopikusan, kivéve az I. lemezen a 4A, 4B, 4C, 3C és 3D cseppüregeket, amelyek az üledékfrakcíó fúziós termékét tartalmazták HAT-táptalaj nélkül. Ezekben a cseppüregekben már a fúzió után 5 nappal telepek voltak észlelhetők, amelyek gyorsan növekedtek. A fúzió utáni 8 napon ezekbe a cseppüregekbe HAT-táptalajt adagoltunk: 4 napon belül az összes látható telep elpusztult. A fúzió után 27 nappal eleinte egyenként, azután közel minden csepptálcában telepek voltak láthatók, amelyek nagy, gömbalakú, átlátszó, nem összetapadóan növő sejtekből álltak. A fúzió után 65 nappal az I-.3B, II-1A, II-4A kivételével minden cseppüregben limfoid sejtek többszörös telepei voltak, A tenyészet-felülúszók egér-Ig-tartalomra való vizsgálata ezen a napon - amint az 1. táblázat adatai mutatják - pozitívtől erősen pozitívig terjedő értékeket mutatott EhlSA-tesztben minden tenyészet-részletben kivéve a fentemlített telepmentes cseppüregeket. 1. táblázat. ELISA-teszt egér-immunglobulin kimutatására a B~kísérlet tenyészet-felülúszóiban (65 nappal a fúzió után). I. csepptenyészet-lemez: HAT nélkül. (Kivétel: 4A, 4B, 4C, 3C, 3D: +HAT, 8-15 nap). 1 2 3 4 5 6 A 664 601 706 632 B 526 766 011 633 C 576 769 855 623 D 794 1500 791 t T t 1 2 3 1 = citoplaszt-fúzionátpm 2 = karioplaszt-fúzionátum 3 = üledék se jt-fúzionátum II. csepptenyészet-lemez HAT-tal (1-14 nap) i 2 3 4 5 6 A 008 568 580 000 B 267 538 539 547 C 656 530 729 822-D l 848 570 605 T t T 1 2 3 negatív-tenyészet 1 (DMEM-teljes táptalaj) : 010 negatív-tenyészet 2 (DMEM, FKS nélkül) : *040 pozitív-tenyészet 1 (egérszérum lxlO'3) : 723 pozitív-tenyészet 2 (egérszérum lxlO'2) : >1500 a) Karioplasztok egér-lépsejtekkel való fúziója in vitro szaporodósképes, immunglobulin-termelő sejtekhez vezetett. Jóllehet. a rosszindulatú partner cítoplazmájának csak egy kis részét vittük át a hibridbe, nem került sor a .permanens növekedés" jellegének lehetséges kioltására. b) \ karioplasztok kai képzett hibridsejtek . hi bridoma '-mennyiségekben szintetizál5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
