196456. lajstromszámú szabadalom • Eljárás permanens állati és humán sejtvonalak előállítására
26 196456 27 cites-sejtekból nyert CMV-frakcióval szuszpenzióban fuzionáljuk. Az igy kezelt sejteket 5 x 105/75 cm2 tenyészedény sejtsürüségének megfelelően szélesztjük, és szén-dioxid inkubátorban tenyésztjük. Ellenőrzés céljából a primer tenyészetekből származó endotelium-sejtek egy aliquotját CMV-frakció nélkül PEG-oldattal kezeljük (álfúzió), és újra tenyésztjük. Amint a sejtek a tenyészedény alján hiánytalan sejtréteget képeznek, tripszin-EDTA-oldat segítségével leoldjuk őket, és 1 : .3 arányban friss tenyészedényekbe visszük át őket (= átoltás). 7.2. Eredmények. A CMV-frakcióval fúzionált endotelium-sejtek a beoltás után 20-30%-os eredményességgel tapadnak meg, és 2-3 napon belül összefüggő sejtréteggé nőnek. Az álfúzionált sejtek körülbelül azonos ereményességgel tapadnak meg, azonban alig szaporodnak, és - anélkül, hogy összefüggő sejtréteget képeznének - körülbelül 21 napon beiül teljesen kipusztulnak. A teljesen kezeletlen endotelium-sejtek legfeljebb a 3. átoltásban szaporodnak, azután leáll a növekedésük, a tenyészedény aljái'ól legömbölyödve leválnak, és feloldódnak. Összesen 18 különböző köldökzsinórból származó endotelium-sejtekkel végzett 8 különböző kísérletben a CMV-vel kezelt sejtek problémamentesen kinőttek a 10. átoltáson túl is. A transzformált endotélium-sejtek életképesség- és osztódási képesség-veszteség nélkül tárolhatók folyékony nitrogénben. 7.3. Értékelés. Humán köldökzsinór-endotelium-sejtek a találmány szerinti transzformáló manipuláció nélkül a 3. átoltáson túl nem voltak tenyészthetők, ami megerósitette az irodalomban közzétett próbálkozásokat [például Grimbone, M. A., Progress in Haemostasis and Thrombosis, Vol. 3; Maciag, T. et. el.; J. Cell Bioi. 91 420-426 (1981)]. Ehrlich-ascites-sejtekból származó mitokondrium-gazdag CMV-frakcióval való fúzióval az endotelium-sejtek tenyésztési tuladonságai úgy megváltoztak, hogy a kritikus 3. átoltáson túl problémamentesen szaporíthatok voltak (és a 23. átoltásban sem mutattak .kifáradási jelenségeket"). 8. példa. Emberi melanóraasejtek immortalizálása. 8.1. Anyag és módszerek. Melanómasejt-tartalmú szövetet egy csípő-nyirokcsomó-áttétel sebészeti kimetszésével nyertünk, steril körülmények között kis csikókra vágtuk, és a fúzióig folyékony nitrogénben tároltuk. Az Ehrlich-ascites-sejtekböl származó CMV-frakciókat a 6.1. példában leírtak szerint állítottuk elő. A fúzió előtt a melanómasejt-tartalmú anyagot felolvasztottuk, és tripszin-kezelés segítségével egyedi sejt szuszpenziót készítettünk. A nagy, barnás-vörös pigmentáltsógú melanómasejteket Ficoll-gradiens-centrifugálással megszabadítottuk a kísérő limfocitáktól, és a 6.1. pontban leirtak szerint PEG-behatás alatt CMV-frakcióval fúzionáltuk (körülbelül 4 x 105 melanómasejtet körülbelül 1 x 106 Ehrlich-ascites-sejtból származó CMV-vel). Fúziókontrollként 4 x 105 melanómasejt szolgált, amelyeket CMV nélkül PEG-lal kezeltünk. A sejteket a fúzió utón 1 x 105 sejt/csepptenyészet-tálca sűrűségben RPMI 1640 + 20% FKS-ben szélesztettük, és 37 °C-on 5%-os szén-dioxid-atmoszférában tenyésztettük. 8.2. Eredmények. A CMV-vel fúzionált melanómasejtek mind a 4 résztenyészetében a 28. naptól kezdve tipikusan pigmentált sejtek telepei nőttek félig össztapadó sejthalmazok formájában, amelyek folytonosan nagyobbodtak. Az álfúzionált sejtek kontroli-tenyészetében nem került sor sejtszaporodásra, továbbá a sejtek a 8. naptól kezdve fokozódó granulálódást mutattak, és a 22. naptól már csak sejtromok voltak a tenyészetben jelen. 8.3. Értékelés. Fagyasztással tartósított áttétel-szövetekből nyert humán melanóma-sejtek CMV-fúzióval in vitro tenyészthetők és szaporodásképes sejtekké; transzformálhatok. Azonos eredetű álfúzionált melanómasejtek ezzel szemben egyébként azonos tenyésztési körülmények között elpusztulnak. 9. példa. Eukariota-DNS-vektor bevitele immortalizólt emberi endotelium-sejtekbe. 9.1. Transzficiált anyag kimutatása a sejtekben Hirt-felülúszók lenyomatolósával (Southern blotting). 9.1.1. Anyag. Z-pBR 322/RchrßG-A425 B plazmid [Dierks, P. et ah; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 1411-1415 (1981)] egy 2.070 bázispár (Bp) házinyúl-á-globin-gén-fragmenst tartalmaz. A pBR 322 Cla-Pvu I-fragmensét egy 3.039 Bp Hpa I-BamHI-fragmenssel pótoltuk, amely a korábbi gén egész részletét és az SV 40 későbbi génje részletének kezdetét tartalmazza [Tooze, J. (1980), .DNS tumor vírusok", J. Tooze kiadása, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory és B. Wieringa et al.; Cetus-UCLA Symposium on Gene Regulation, 1982]. 9.1.2. Módszerek. Emberi endotelium-sejteket a 7. példában leirtak szerint immortalizálunk és tenyésztünk. 106-106 sejtet 6 wg pBR 322 RüG SV 40-nel és 4 ug ultrahanggal 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
