196456. lajstromszámú szabadalom • Eljárás permanens állati és humán sejtvonalak előállítására
28 196456 29 kezelt borjútimusz DNS-sel transzficiálunk a kalcium-foszfátos lecsapási módszer [Graham, F. L. és mtsai., Virology 52, 456-467 (1973) és Wigler, M. és mtsai., Cell 14, 725-731 (1978)] alkalmazásával. A transzfekció után 10 órával és 40 órával Hirt-felülúszókat készítünk [Hirt, B., J. Mól. Bioi. 26, 365-369 (1967)]. A Hirt-felülúszókat 1%-os agaróz-gélen elválasztjuk, és Southern módszere szerint [Sourhern, E. M., J. Mól. Bioi. 98, 503-517 (1975)] nitrocellulóz-papirra átvisBzük. A pBR 322 RűG SV 40 plazmidot a Nick-transzlációs módszer [Rigby, P. W. és mtsai., J. Mól. Bioi. 113, 237-251 (1977)] alkalmazásával 32P-vel jelezzük, és az átvitt DNS-sel a nitrocellulóz-szürön hibridizáljuk Manialis, T. és mtsai. leírása szerint [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. A szűrőt röntgenfilmen -70 °C-on exponáljuk. 9.1.3. Eredmények. A pBR 322 RűG SV 40 plazmiddal transzficiált emberi endotelium-sejtek erős hibridizálási jelet adnak, amely agarózgélen való mobilitására való tekintettel az autentikus plazmidnak felel meg. A transzfekció utáni 40 órás sejtek Hirt-felülúszói jelének összehasonlítása a transzfekció utáni 10 órás sejtekével a hibridizálási jel intenzitásának négy - ötszörös erősödését mutatta. Hibridizálás olyan DNS-fajtókon is észlelhető volt, amelyek kisebbek, mint a bevitt plazmid. Ezek a jelek nem transzficiált immortalizált emberi endotelium-sejtekben nem voltak megállapíthatók. A hibridizálási-jelek azonos intenzitásmegoszlását észleltük, ha HeLa-sejteket pBR 322 RßG SV 40 plazmiddal transzficiáltunk. 9.1.4. Értékelés. Az a tény, hogy olyan emberi immortalizált epitelium-sejtek Hirt-felülúszóiban, amelyek pBR 322 RűG SV 40 plazmiddal voltak transzficiálva, 32P-jelzett bevitt plazmidon DNS-hibridizálódást állapítottunk meg, nem transzficiált sejteknél azonban nem, bizonyíték arra, hogy a vektort az eukoriota sejtvonalba bevittük. Az a megfigyelés, hogy a hibridizálási jel a transzfekció utáni 40 órás transzficiált sejteknél négy - ötször erősebb intenzitást mutatott, mint a transzfekció utáni 10 órás sejteknél, azt a végkövetkeztetést engedteti meg, hogy a transzficiált plazmid a sejtekben replikólódott. 9.2. Nyúl-ü-globin specifikus átiratok kimutatása immortalizált emberi endotelium-sejtekben, amelyeket pBR 322 IljG SV 40 plazmiddal transzficiáltunk. 9.2.1. Anyag. Nukleázokként Si-et, T4 polinukleotidkinázt és borjúbélfoszfatázt használtunk, amelyek a Boehringer Mannheim cég kereskedelmi forgalomban lévő preparátumai. 9.2.2. Módszerek. Immortalizált emberi epitélium-sejteket szaporítunk a 9.2.1. pontban leírtak szerint, és a nyúl-ű-globin-gént tartalmazó vektorral transzfíciáljuk. A transzfekció után 48 órával 1-2 x 106 sejtet lizisnek vetünk alá, és az RNS-t a lítium-kloridos karbamidos módszerrel [Auffray, C. és mtsai., Eur. J. Biochem. 107, 303-314 (1980)] extraháljuk. Nyúl-/3-globin specifikus hibridizálási szonda előállítása. pBR 322 R/3G SV 40 plazmidot Hae III— -mai lebontunk, és a +135-től -75-ig terjedő fragmenst [Dierks, P. et alM Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 1411-1415 (1981) és Van Oyen, A. et al., Science 206, 337-344 (19)] 2%-os agarózgélen elkülönítjük, és DEAE-cellulóze kromatográfiával tovább tisztítjuk [Müller, W. et al., J. Mól. Bioi. 124, 343-358 (1978)]. A fragmenst bor júbélfoszfatázzal 32P-defoszforilezzük, és •g-^P-ATP-vel és T4 polinukleotidkinázzal jelezzük a Mantei, N. és mtsai. által leírtak szerint [Gene 10, 1-8 (1980)]. Si nukleáz térképezés. A kinázzal kezelt fragmenst 10 pg E. coli t-RNS-sel (Boehringer Mannheim) együtt etanollal kicsapjuk, és 100 /ul O, 4 mól/liter nátrium-klorid, 1 mmól/liter EDTA, 40 mmól/liter Pipes-puffer (pH 6,4) és 80% formamid összetételű oldatban oldjuk [Mantei, N. et al., Nature 281, 40-46 (1979)]. A cellulárís RNS-t (= 25 ug) vákuumban szárítjuk, 10 ul fent leírt pufferral készített 0,01 pmól (30.000 cpm) szonda oldatában oldjuk, denaturáljuk, üvegkapillárisba leforrasztjuk, és 16 órát 48 °C-on hibridizáljuk. Kontrolikísérletben a szondát nyul-ß-globin m-RNS-sel (Miles) hibridizáljuk. A mintát 100 pl 0,2 mól/liter nátrium-klorid, 50 mmól/liter 4,5 pH-jú nátrium-acetát puffer, 1 mmól/liter cink-szulfát és 0,5% glicerin össztételű oldatban oldjuk, és 50 egység Sí nukleázzal 30 °C-on 60 percig inkubáljuk [Weaver, R. et al., Acid Res. 7, 1175- -1193 (1979)]. A mintákat fenollal kezeljük, 10 pg E. coli t-RNS-sel együtt etanollal kicsapjuk, 80%-os etanollal -70 °C-on 20 percig mossuk, vákuumban szárítjuk, 5 pl szinezékoldatban (0,05% brómfenolkék, 0,05% xilolxianol, 1 mmól/liter EDTA, 90 térf% formamid) oldjuk, 2 percig forrásban lévő vízfürdőben melegítjük, és 5% poliakrilamidgélen (89 mmól/liter trisz-bózis, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 16
